Abstrak

Biodegradasi fenol dengan kultur murni Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833 yang terlebih dahulu diadaptasikan bertingkat pada konsentrasi komposisi nutrisi yang berbeda dan dengan konsentrasi fenol sebesar 500 ppm. Analisa hasil degradasi ditentukkan secara kolorimetri dengan menggunakan 4-aminoantipirin dan kalium ferrisianida sebagai oksidator pada pH 10,2 untuk penentuan sisa fenol Diketahui bahwa untuk kultur murni Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833 setelah diadaptasi tiga kali selama sepuluh hari mampu mendegradasi fenol sebesar 495,88 ppm.

Industri yang berkembang cepat, limbah rumah tangga yang semakin berlimpah ruah berakibat pencemaran dan dapat dipastikan akan meningkat pula dari tahun ke tahun. Walaupun sejumlah usaha telah dilakukan Pemerintah untuk mengatasi masalah ini, namun kesadaran masyarakat yang masih rendah merupakan kendala utama, sehingga tidak berjalannya beberapa program Pemerintah dalam penanggulangan limbah tersebut.

Fenol dan derivat-derivatnya merupakan polutan yang sangat berbahaya di lingkungan karena bersifat racun dan sangat sulit didegradasi oleh organisme pengurai¹. Fenol adalah senyawa kimia yang bersifat korosif yang dapat menyebabkan iritasi jaringan, kulit, mata dan mengganggu pernapasan manusia. Nilai ambang batas senyawa fenol untuk baku mutu air minum sebesar 0,001 ppm, mutu buangan air industri sebesar 0,3 ppm serta di lingkungan para pekerja gas fenol adalah 0,3 ppm². Fenol di alam mengalami transformasi kimia, biokimia, dan fisika. Namun proses alami saja tidak cukup untuk menuntaskan permasalahan yang timbul. Hal yang menimbulkan permasalahan harus segera diatasi sehingga fenol dan derivat-derivatnya perlu ditiadakan atau dikurangi sampai dengan nilai batas ambangnya. Manfaatnya adalah mencoba mengurangi bahaya yang ditimbulkan oleh fenol, yaitu terbentuknya senyawa hasil degradasi yang tidak membahayakan atau menimbulkan racun di alam

Penelitian biodegradasi ini dilakukan pada skala laboratorium, yang difokuskan pada pemecahan komponen tunggal dengan menggunakan kultur murni. Fenol merupakan racun protoplasmik yang toksik terhadap segala jenis sel. Kadar fenol yang tinggi akan mengendapkan protein, sedangkan kadar rendah akan mendenaturasi protein tanpa koagulasi³. Biodegradasi fenol adalah terjadinya pengrusakkan cincin aromatik oleh mikroba pada proses anaerobik dan aerobik⁴. Senyawa aromatik baik secara total maupun sebagian dapat didegradasi oleh mikroorganisme tergantung pada jumlah cincin dan jenis substituennya. Reaksi-reaksi tersebut meliputi⁵ :

1. infiltrasi kedalam sel, yaitu :

· tidak ada resistensi dalam terhadap transportasi massa.

· Biomassa terdistribusi serba sama melalui medium

2. transformasi sisi rantai

3. modifikasi pensubstitusi dan perubahan senyawa-senyawa aromatik

MATERIAL DAN METODA

Material.

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833 didapat dari laboratorium Kuman dan Jamur RSUD Dr. Sutomo Surabaya. Media biakan bakteri : ekstrak ragi, pepton, ekstrak daging, glukosa anhidrat, NaCl, air destilasi steril dari Aldrich dan bahan untuk analisa yang terdiri dari 4-aminoantipirin, dikalium hidrogen fosfat, kalium dihidrogen fosfat, kalium ferrisianida, ammonium hidroksida 0,5 M dan air destilasi didapatkan sebagian dari laboratorium Kimia FMIPA ITS di Surabaya.

Metoda

Pembuatan media pembiakan

Dilarutkan 2,5 g ekstrak daging, 1,25 g ekstrak ragi (yeast), 1,25 g pepton, 0,4 g NaCl, 0,6 g glukosa dalam 100 mL air destilasi, ditambahkan 2 g agar kemudian dipanaskan sehingga agar melarut, selanjutnya disikan pada tabung reaksi sebanyak 3-5 mL, disumbat mulut tabung reaksi dengan kapas yang sudah dibungkus dengan aluminium foil, disterilkan dalam autoclave. Setelah sterilisasi selesai, tabung reaksi tersebut diletakkan miring hampir horizontal, dan dibiarkan dingin sampai mengental.

Peremajaan biakan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833

Biakan bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833 diperbanyak dengan cara memindahkan biakan bakteri pada pembiakan agar miring yang baru. Pemindahan dilakukan dengan kawat oce yang ujungnya sudah dipijarkan dulu dengan nyala api reduksi dari Bunsen sampai pijar sedangkan bagian lainnya cukup dilewatkan pada api itu saja dan sambil didinginkan. Mulut tabung reaksi dipanaskan setelah sumbatnya dibuka. Ujung kawat oce disentuhkan pada koloni bakteri induk, digesekkan pada media baru dari bawah keatas media. Setelah selesai inokulasi mulut tabung reaksi tempat pertumbuhan baru dipanasi dan disumbat kembali.

Penentuan konsentrasi fenol maksimum sebagai substrat pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833

Ditentukan dengan melalui pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa didalam larutan fenol dengan konsentrasi berturut-turut, 100 ppm,150 ppm, 200 ppm, 250 ppm 300 ppm, 350 ppm, 400 ppm, 450 ppm, 500 ppm, 550 ppm, 600 ppm, 650 ppm,

700 ppm, 750 ppm, 800 ppm, 850 ppm, 900 ppm dengan volume tiap tabung reaksi

15 mL. Inkubasi dilaksanakan selama 36 jam. Kemudian masing-masing tabung reaksi dengan konsentrasi tersebut diukur kekeruhannya dengan menggunakan spektronik 20 D pada panjang glombang 505 nm serta media pertumbuhan fenol tanpa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833 sebagai blanko. Didapatkan kekeruhan tertinggi yang merupakan konsentrasi maksimum dari fenol pada pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833.

Pembuatan kurva pertumbuhan

Pembuatan kurva pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833, yaitu jumlah massa sel yang ada dalam medium versus interval waktu tertentu. Disiapkan nutrisi cair yang mengandung ekstrak ragi 1,25 g, ekstrak daging 2,5 g, pepton 1,25 g,

0,4 g NaCl, 0,6 glukosa seperti pada pembuatan media biakan terdahulu pada gelas Erlenmeyer dengan volume 300 mL, dan disterilisasi dengan autoclave, ditambahkan larutan fenol pada nutrisi, yaitu dengan konsentrasi fenol maksimum untuk pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833 tersebut. Kemudian diinokulasikan bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833, dan diambil 15 mL untuk turbiditas jam ke 0 (nol), kemudian diinkubasikan pada shaker. Pengukuran dilaksanakan pada jam 2, 4, 6, dan 12 untuk mengetahui permulaan fasa eksponensial, yang kemudian pengukuran dilakukan pada setiap 6 jam.

Perlakuan adaptasi bertingkat Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833

Dilakukan adaptasi Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833 sebanyak 4 tingkat media yang kandungan nutrisinya makin berkurang pada tiap tingkatan sedangkan konsentrasi fenolnya tetap, dilakukan inkubasi. Kemudian Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833 hasil adaptasi tingkat pertama diambil setelah 24 jam inkubasi. Pengambilan dilakukan dengan alat suntik steril sebanyak 5 mL, yang kemudian diadaptasikan pada medium ke 2, dilakukan inkubasi selama 24 jam. Hal yang sama dilakukan pula pada tahap ke 3, dan tahap ke 4.

Komposisi tiap nutrisi yang diberikan untuk tiap tingkat dapat dilihat pada Tabel I berikut:

Tabel I. Komposisi nutrisi tiap adaptasi

Adaptasi ke-

Komposisi nutrisi

I II III IV

Ekstrak ragi (yeast) g 1,25 1,00 0,75 0,50

Ekstrak daging g 2,5 2,00 1,50 1,00

Pepton g 1,25 1,00 0,75 0,50

Glukosa g 0,60 0,50 0,40 0,30

NaCl g 0,4 0,3 0,2 0,10

Air mL 100 100 100 100

Fenol ppm 500 500 500 500

Pengukuran fenol hasil degradasi

Pengukuran kadar fenol sisa hasil degradasi dilaksanakan tiap 24 jam sekali selama 10 hari. Pengukuran dilaksanakan dengan metoda kolorimetri setelah pemisahan biomassa dengan menggunakan sentrifuge kecepatan 3000 rpm. Tata cara kerja pengukuran, yaitu dengan mengencerkan 1 mL cuplikan menjadi 100 mL, diberi 2,5 mL NH₄OH 0,5 M, kemudian diaduk dengan pengaduk dan ditambahkan larutan penyangga fosfat pH 6,8 sehingga pH larutan menjadi 10,2, kemudian ditambahkan lagi 1 mL 4-aminoantipirin 2 % dan kalium Ferrisianida 8 %, larutan akan berwarna merah, diaduk selama 15 menit, kemudian diukur, yaitu dibaca serapannya pada panjang gelombang yang telah didapatkan. Hal yang sama dilakukan pada pengukuran pelarut blanko tanpa senyawa fenol.

Diskusi Dan Hasil

Dari data percobaan ditemukan bahwa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833 tumbuh dengan baik dan dapat menyesuaikan diri pada konsentrasi fenol 500 ppm.

Pada kurva pertumbuhan Pseudomonas aeruginosaATCC 27833 terlihat pada jam ke 0 sampai jam ke 4 sangat lambat petumbuhannya. Keadaan ini terjadi karena adanya penyesuaian diri terhadap lingkungan dan disebut fasa lag. Pada fasa ini reaksi antara enzim dan substrat akan terjadi setelah konformasi enzim sesuai dengan substratnya.

Sumber : Setiabudi, I. 1995⁹

Gambar 1. Kurva pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833

Kemudian dari kurva tersebut terlihat bahwa Pseudomonas aeruginosaATCC 27833 mulai dapat menyesuaikan dirinya dengan lingkungan. Makin lama terlihat kecepatan pertumbuhan sel yang sangat tinggi nampak pada inkubasi diantara 10 – 36 jam, yang diikuti dengan konsumsi mikroba terhadap nutrien yang berakibat nutrisi pada medium jauh berkurang, keadaan seperti ini disebut fasa logaritmik, yang merupakan suatu garis lurus hasil antara ln x (massa sel) versus waktu (t). Selama pertumbuhan cairan yang berisikan komponen kimia terus menerus dikonsumsi dan sintesis yang dihasilkan adalah produk metabolisma yang terjadi serta berakibat lingkungan menjadi kurang stabil. Pada saat waktu inkubasi 36 jam sampai dengan 45 jam pertumbuhan sel-sel Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833 menjadi tetap yang berarti bahwa jumlah sel yang mati sama dengan jumlah sel yang berkembang biak.

Kemudian pada saat inkubasi mulai dari 45 jam sampai dengan seterusnya terjadi penurunan pertumbuhan sel, karena kekurangan konsumsi makanan sehingga terjadi penurunan aktifitas sel. Fasa ini disebut fasa kematian. Oleh karena itu pemindahan inokulum Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833 dilakukan pada jam ke 15 sampai dengan jam ke 30, yaitu pada saat pertumbuhan maksimum.

Adaptasi Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833 pada medium yang mengandung konsentrasi fenol 500 ppm bertujuan untuk menginduksi enzim pendegradasi fenol tersebut. Enzim akan menyesuaikan konfomasi, sehingga terjadi reaksi antara enzim dengan substrat yang produknya diharapkan tidak berbahaya bagi lingkungan. Enzim-enzim tersebut antara lain adalah monooksigenase, 2,3-dioksigenase, dan dehidrogenase yang sangat berperan terhadap reaksi berikut^6,7 :

Menurut Gibson, T.D. et al. (1990) dan Wackett, L.P. et al. (1988) bahwa hasil degradasi adalah asam asetat. Asam asetat merupakan senyawa yang sangat diperlukan karena akan bereaksi dengan CoA menjadi asetil CoA yang selanjutnya masuk kedalam siklus krebs dan rantai pernapasan yang akhirnya terbentuk energi yang diperlukan untuk aktifitas hidup seperti perkembang biakan, pertumbuhan, gerakan dan sebagainya. Sehingga jelas bahwa hasil biodegradasi fenol adalah senyawa yang tidak beracun dan tidak membahayakan lingkungan.

Sebelum analisa kadar fenol dilakukan maka terlebih dahulu harus ditentukan panjang gelombang pada serapan maksimum untuk menganalisa fenol. Dari hasil yang diperoleh didapatkan sebesar 505 nm. Kemudian panjang gelombang pada serapan maksimum 505 nm digunakan untuk membuat kurva standar fenol dan ditemukan persamaan garis lurus:

Y = 1,345x10^-3 X + 3,830x10^-2

dengan sumbu ordinat adalah absorbansi dan sumbu absis adalah konsentrasi fenol.

Kurva standar fenol yang telah dibuat dari konsentrasi-konsentrasi tertentu yang telah diketahui versus absorbansi, yang akan digunakan untuk menghitung sisa fenol dari hasil yang telah didegradasi.

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833 tanpa diadaptasi terlebih dahulu mampu

memanfaatkan fenol sebagai substrat. Kemudian dilakukan adaptasi bertingkat dengan pengurangan kadar nutrisi yang bertujuan untuk menginduksi enzim.

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833 yang telah mengalami adapasi sebanyak 3 x sampai dengan hari kesepuluh masih tersisa fenol sebanyak 4,12 ppm. Berarti kalau percobaan ini mau diterapkan ke lapangan, sangat jauh dari hasil yang diharapkan mengingat nilai batas ambang yang diperbolehkan. Oleh karena itu disarankan untuk dicobakan pada strain lain dari Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833 atau dengan menggunakan perhitungan yang dinyatakan oleh Uden (1986), yang merupakan modifikasi persamaan Monod dengan memperhatikan :

· pengaruh kecepatan pengaturan spesifik

· faktor hasil maksimum

· transportasi substrat kedalam sel

Persamaannya adalah sebagai berikut ⁸ :

m = {Y_m k_m S/(K_s + S)}- b

m = kenaikkan massa bakteri persatuan substrat yang

dikonsumsi untuk energi

k_m = kecepatan pada saat substrat dikonsumsi untuk

energi persatuan massa bakteri

S = konsentrasi substrat pada batas kecepatan

pertumbuhan

K_s = koefisien yang menyatakan bahwa pada saat

substrat mempunyai konsentrasi tertentu maka kecepatan pertumbuhannya ½x kecepatan maksimum

b = koefisien yang menyatakan peluruhan sel

= kecepatan pemeliharaan spesifik terhadap

penurunan massa mikroba melalui respirasi

endogen, kematian dan lisis

Dengan menggunakan perhitungan ini didapatkan hasil yang lebih teliti dan mendekati keadaan yang sesungguhnya.

Rujukan

1. Molin,Goran and Nilson, I. 1985. Degradation of Phenol by Pseudomonas Putida

ATCC 11172 In Continuous Culture at Different Ratios of Biofilm surface to Culture Volume. Applied and Environment Microbiology. 946-950, American Society for Microbiology.

2. Anonymous, 1990. Lampiran Peraturan peraturan Pemerintah R I Nomor 20. Daftar

Kriteria Kualitas Air Golongan A.

3. Ketchum, A.P.1988. Microbiology,Concept and Application, John A Wiley and Sons,

Inc., NY.

4. Wouter, A.D. et al. 1994, Competition in Chemostat Culture between Pseudomonas

strain That Use Differet Pathway for the Degradation of Toluene. Applied and

Environment Microbiology. 2858-2863. American Society for Microbiology.

5. UTCHEM BIODEGRADATION MODEL DESCRIPTION AND CAPABILITIES

http://www.ce.utexas.edu/prof/mckinney/papers/UTCHEM_BIO/UTCHEM_Bio.html.2000

6. Gibson, T.D. 1990 Microbial Transformation of Aromatic Pollutant Proceeding

International of Microbiology, Pergamon Press, NY.

7. Wackett,L.P. and David T.Gibson.1988 Degradation of Trichloroethylene by

Toluene deoxygenase in Whole-Cell Studies with Pseudomonas putida F₁. Applied and Environment Microbiology. 1703-1705. American Society for Microbiology.

8. Bailey, James E. and David F. Ollis. 1986. Biochemical Engineering Fundametals.

Second Edition. McGraw-Hill International Edition. NY.

9. Setabudi, I., 1995, Degradasi Fenol oleh Pseudomonas aeroginosa dan Pseudomonas

spp, Jurusan KIMIA, FMIPA ITS, Tidak dipublikasikan