© 2001.
Sri Lestari Angka Posted 8 June 2001 (rudyct)
Makalah
Falsafah Sains (PPs 702)
Program Pasca
Sarjana / S3
Institut
Pertanian Bogor
Juni 2001
Dosen:
Prof Dr Ir
Rudy C Tarumingkeng (Penanggung Jawab)
Prof Dr Ir
Zahrial Coto
STUDI KARAKTERISASI DAN PATOLOGI Aeromonas hydrophila
PADA IKAN LELE DUMBO (Clarias gariepinus)
Oleh :
Sri Lestari Angka
(P.18600002)
E-mail: angka@bogor.wasantara.net.id
1.
Latar Belakang
Ikan
lele dumbo (Clarias gariepinus) adalah ikan air tawar yang telah
dibudidayakan secara intensif. Ikan ini cepat pertumbuhannya, tidak membutuhkan
banyak air dan oksigen untuk pemeliharaannya karena mempunyai alat pernapasan
tambahan yang dinamakan “arborescent organ”.Selain itu ia dapat bereproduksi
sepanjang tahun dan fekunditasnya tinggi. Namun salah satu kendala budi daya
ikan ini adalah penyakit yang disebabkan oleh bakteri Aeromonas hydrophila.
Penyakit yang disebabkan oleh A.hydrophila menurut Roberts et.al.1992, dinamakan EUS (Epizootic Ulcerative Syndrome), sedangkan beberapa peneliti lain menamakannya MAS (Motile Aeromonad Septicaemia, Roberts 1993;Thune et.al 1993).
Di Asia Tenggara pertama kali wabah penyakit ini terjadi di Jawa Barat pada tahun 1980, menyebabkan kematian 82,2 ton dalam waktu 1 bulan (Angka et.al.1982) dan berulang lagi terjadi wabah di Jawa Tengah tahun 1984, sebanyak 1.6 ton ikan lele mati (Anonymous 1984). Di Malaysia dan Thailand wabah terjadi tahun 1981, Burma dan Philipina tahun 1985, Sri Langka 1987, Bangladesh, India dan Nepal tahun 1988 (Roberts et.al. 1992 ; Lio Po et.al. 1992). Sampai sekarang penyakit ini masih terjadi di perairan yang mengandung bahan organik tinggi.
A. hydrophila selain menyebabkan ikan dan amfibi sakit juga dapat menular pada manusia melalui luka terbuka atau tertelan bersama air atau makanan. Orang yang tertular A. hydrophila mengalami diare atau septicaemia bila daya tahan orang itu sedang turun (Anonymous 2001).
Aeromonas sp. terdapat dimana-mana, ditanah, perairan tawar, air PAM, dan juga merupakan bakteri flora normal di ikan (Thune et.al 1993). Bakteri ini menyebabkan tukak bila ikan stress (Yin et.al 1995) serta sering kali merupakan penyebab infeksi sekunder (Richards and Roberts 1978; Tonguthai 1985; Roberts et.al 1992; Thune et.al 1993). Penelitian tentang bakteri ini telah banyak dilakukan dan ternyata ia dapat memproduksi endotoksin dan produk ekstraseluler seperti hemolisin a dan b , cytotoksin, enterotoksin, protease dan leucocidin (Allan and Stevenson 1981; Lallier and Daigneault 1984; Morgan et.al 1985; Kanai and Takagi 1986; Thune et.al 1986; Santos et.al 1987). Galur bakteri ini yang diisolasi dari ikan sakit lebih virulen dari isolat yang berasal dari perairan (de Figueiredo and Plumb 1977). Virulensi juga tergantung pada interaksi in vivo dari endotoksin, permukaan antigen dan produk ekstraseluler. Pertumbuhan bakteri yang cepat dan produksi ekstraseluler yang dihasilkannya adalah penyebab terjadinya gangguan fisiologis dan kematian ikan yang terinfeksi (Brenden dan Huizinga 1986).
Mekanisme patogenitas A hydrophila belum banyak diketahui, penelitian tentang toksin yang dihasilkannya telah banyak dilakukan dan sedikitnya telah ditemukan 6 toksin dari galur bakteri ini.(Austin and Austin 1987). Karena bakteri ini dapat memanfaatkan albumin, casein, fibrinogen dan gelatine sebagai substrat protein maka dapat disimpulkan galur bakteri ini bersifat proteolitik (Shotts et.al 1985), sehingga berpotensi besar sebagai patogen ikan .Menurut Nieto and Ellis 1991, sedikitnya ada empat atau mungkin lima macam protease ekstraseluler dari A hydrophila.
Protease berfungsi untuk berkembangnya penyakit dengan cara melawan pertahanan tubuh inang dan mengambil penyediaan nutrien sehingga memungkinkan bakteri berkembang biak. Karena sering kali organ dalam ikan yang terinfeksi A. hydrophila mengalami hemoragi (Hazen et.al 1978) yang ditunjukkan dengan terjadinya hemolisis secara invitro maka hemolisin juga dianggap sebagai faktor virulen utama dari A. hydrophila (Allan and Stevenson 1981; Thune et.al 1986). Belum banyak diketahui mengenai efek klinis A. hydrophila in vivo (Allan and Stevenson 1981; Kanai and Takagi 1986), terutama efek produk ekstra seluler pada ikan, dan mekanisme virulensinya (Anonymous 2001).Sampai sekarang studi hematologi masih dianggap kriteria penting untuk diagnosa dan penentuan kesehatan ikan (Mc Carthy et.al 1973; Allan and Stevenson 1981; Boon et.al 1990).
Dengan memisahkan galur isolat virulen, mengetahui efek patologi dan hematologi galur ini serta mempelajari patogenitasnya maka pengaruh A. hydrophila terhadap ikan sebagai inang makin jelas. Untuk selanjutnya ada kemungkinan untuk menggembangkan vaksin yang merupakan cara pencegahan wabah penyakit EUS.
2.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui patogenitas penyakit ini secara lebih teliti dan tepat serta kemungkinan pencegahan terjangkitnya wabah penyakit yang sering kali terjadi di tempat budidaya ikan air tawar. Untuk mencapai tujuan ini perlu dilakukan penelitian beberapa tahap yaitu :
3.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi pengertian lebih jelas dan benar tentang patogenitas penyakit ini dan kemungkinan cara pencegahan terjadinya wabah penyakit di tempat budidaya ikan air tawar.
4.
Tinjauan Pustaka
Bakteri A. hydrophila tersebar luas di perairan air tawar terutama yang mengandung bahan organik tinggi, dapat diisolasi dari perairan payau, muara sungai dan laut (Hazen et.al 1978; Seidler et.al 1980 Juga dari air PAM, tanah dan tinja serta merupakan flora normal dari ikan (Thune et.al 1993). Bakteri ini juga menyebabkan penyakit haemorrhagic septicaemia (Lewis and Plumb 1979) pada ikan tropika maupun dari daerah beriklim sedang (Austin and Austin 1987)
Galur A.hydrophila menghasilkan berbagai toksin ekstraseluler atau enzim yang mungkin merupakan faktor virulen.(Buckley et.al 1981). Kedalam kelompok ini termasuk gelatinase, protease, caseinase, elastase, lipase, lecithinase, hemolisin, cytotoksin, dan enterotoksin (Boulanger et.al 1977; Cumberbatch et.al 1979; Riddle et.al 1981; Nieto and Ellis 1991).
A.hydrophila adalah bakteri gram negatif dan struktur permukaan yang utama adalah LPS (Lipopolysaccharide) yang dikenal sebagai endotoksin. Toksin ini menyebabkan radang dan demam pada hewan inang. LPS dari A. hydrophila yang patogen pada ikan mengandung rantai polysaccharide O (Dooley et.al 1985). Selain ini beberapa galur patogen bakteri ini mempunyai stuktur permukaan lain yang disebut S-layer yang dapat dipisahkan dengan perlakuan pH rendah (Dooley and Trust 1988). A Casc©n et.al 2000, menyatakan bahwa protease menghidrolisa casein dan elastin .Gen ahpA dari A.hydrophila yang mengkode serin protease ekstraseluler yang disebut AhpA telah diklon ke plasmid pUC18. Selanjutnya inokulasi mutan ahpA dari A.hydrophila ke ikan trout diduga bahwa sebagian besar AhpA protease yang disekresi tidak berkaitan erat dengan virulensi bakteri.Menurut Atkinson and Trust 1980 beberapa A.hydrophila mengaglutinasi sel darah merah manusia dan ternyata pili berperan dalam hemaglutinasi. Penyakit ikan yang disebabkan oleh A.hydrophila. mempunyai beberapa nama yaitu haemorrhagic septicaemia atau infectious abdominal dropsy atau red mouth disease (Stickney 1979 ).Masa inkubasi penyakit ini antara 10-14 hari ( Bullock et al 1971; Meyer 1975 ).Gejala klinis yang terjadi pada ikan yang terkena penyakit ini yaitu tukak berwarna keabu abuan, radang ginjal,hati berwarna hijau pucat dan perdarahan di usus ( Bullock et al 1971 ).Ikan yang sakit pra akut tidak menunjukkan gejala apa apa,tetapi langsung mati,sedangkan yang akut menunjukkan hemoragi di insang,anus dan organ dalam serta juga didapatkan adanya cairan dan darah di rongga perut. Untuk penyakit yang kronis ditunjukkan adanya pembengkakan yang kemudian berkembang menjadi tukak ( Mc Daniel 1979 ).
Huizinga et al 1979 , mendapatkan bahwa luka di bagian luar tubuh ikan kakap yang terkena penyakit merah ( red sore disease )yang kronis dapat berupa tukak setempat sampai di sekujur tubuhnya.Selain itu juga hemoragi setempat , pembengkakan , nekrose dari bagian kulit sampai di urat daging disebelah bawahnya dan organ dalam seperti hati dan ginjal. Untuk kasus yang sakitnya parah ternyata terjadi kerusakan secara menyeluruh dari organ hati dan ginjal ,tetapi tidak begitu parah bagi limpa dan jantung.
Dari percobaan ikan lele lokal ( Clarias batrachus ) yang disuntik dengan galur A.hydrophila virulen,Angka 1990 mendapatkan bahwa ikannya tampak lemas dan tidak ada nafsu makan sampai akhirnya mati. Ternyata setelah dibedah diketahui bahwa organ dalamnya yaitu hati dan ginjalnya terjadi nekrosis setempat juga tampak ada hemoragi (perdarahan )dan peradangan di ginjal,urat daging punggung dan usus.
Menurut Llobrera and Gacutan 1987,A.hydrophila selalu dikaitkan dengan terjadinya tukak nekrotik dan luka-luka pada ikan gabus,lele,ikan mas dan ikan gobi.Tetapi bila ikan yang sakit dipindah ke lingkungan air yang lebih bersih,ternyata luka dan tukaknya sembuh,walaupun bekasnya tampak menghitam.
Hewan secara fisiologis mempunyai pertahanan tubuh non spesifik terhadap suatu infeksi dengan memberikan respons secara langsung terhadap agen asing yang masukHal ini ditujukkan pada saat terjadi radang,makrofag merupakan pelindung tubuh dengan cara memakan berbagai benda asing dan debris dan mengubahnya menjadi bentuk terlarut bila memungkinkan.Sehingga dengan demikian dapat dimanfaatkan tubuh dan dibuang sebagai produk buangan ataupun dapat merangsang respon kekebalan tubuh ikan. ( Ellis 1981 ).
Sel darah putih khususnya jenis netrofil ditemukan pada stadium pertama peradangan ( Roberts 1978 ).Ternyata untuk penyakit bakterial netrofil bertambah banyak di dalam darah,kemudian menembus keluar pembuluh darah lalu masuk kedaerah radang untuk membunuh bakteri ( Dellman and Brown 1989 ).Bersama netrofil,basofil termasuk kelompok granulosit tetapi di ikan fungsinya masih belum diketahui.Kelompok lainnya yaitu agranulosit terdiri dari trombosit,monosit dan limfosit salah satu jenis darah putih yang ukurannya lebih kecil dari sel darah merah ( Chinabut et al 1991).Trombosit sekalipun paling kecil ukurannya tetapi penting peranannya untuk pembekuan darah.Jenis yang lain yaitu monosit atau juga dikenal sebagai makrofag ,terdapat dekat dengan endotel pembuluh darah, yang selalu siap bergerak masuk kedalam jaringan serta berkaitan dengan sistem kekebalan tubuh ikan ( Dellman and Brown 1989 ).
Pada penyakit dropsy yang akut,kadar hemoglobin menurun (Lucky 1977 ).Jadi jelaslah parameter darah seperti kadar hematokrit ,hemoglobin dan leukogram merupakan cara yang penting untuk diagnose suatu penyakit atau menentukan kesehatan ikan.
5.
Metodologi
Isolasi bakteri dilakukan dari luka dan ginjal ikan yang sakit , juga dari ginjal ikan yang sehat secara aseptis.Selanjutnya isolat dibiakkan dalam media TSA ( Tryptic Soy Agar ) dan RS ( Rimler Shotts Agar ) dan diinkubasi dalam suhu ruang ( 28- 31)0 C selama 24 jam.Koloni yang berwarna krem putih dan tumbuh terpisah dipilih untuk selanjutnya dimurnikan dan diidentifikasi berdasarkan metode Popoff 1984; Frerichs and Millar 1993 dan dimantapkan dengan uji biokimiawi memakai kit diagnostik API 20E.
Produksi hemolisin atau derajat aktivitas hemolitik suatu isolat di uji terhadap berbagai jenis darah hewan. Cara penentuannya dengan menumbuhkan setiap isolat dalam media TSA yang ditambahkan sel darah merah kelinci, kuda , sapi, domba dan manusia. Daerah transparan yang terjadi disekitar koloni bakteri menunjukkan derajat aktivitas hemolitiknya.
Galur A.hydrophila yang adalah isolat yang sama dengan diatas ,diuji dengan analisis koloni hibridisasi DNA-DNA untuk menentukan adanya gen hemolisin ( AHH-1, AHH-5 dan ASA ).Gen hemolisin AHH-1 diklon dari A.hydrophila galur ATCC 7966 ( Hirono and Aoki 1991 ), gen AHH-5 dari A.hydrophila galur AH-1 sedangkan ASA dari A.sobria galur 33.Semua galur bakteri yang digunakan adalah galur virulen yang mempunyai gen hemolisin.Fragmen DNA ini digunakan sebagai probe dan dilabel dengan radioisotop (a32 p )d CTP menggunakan random priming labelling kit ( Takara Shuzo Co,Ltd.,Kyoto,Japan ).
Isolat A.hydrophila yang ada untuk selanjutnya dikelompokkan menjadi kelompok virulen, virulen lemah dan avirulen,berdasarkan gen hemolisin,aktivitas hemolitik serta penentuan LD50 berdasarkan metode Reed and Müench 1938.
Studi patologi dilakukan dengan menggunakan satu galur virulen yang dipilih di antara galur uji tersebut diatas,dan kemudian dibuat 3 sediaan sebagai berikut:
1.Sel utuh tanpa pencucian,diharapkan eksotoksin yang dihasilkan bakteri merupakan sediaan uji.
2. Sel utuh yang telah dicuci dengan larutan garam fisiologis, merupakan sediaan bakteri yang bersih dari toksin.
3. Sel bakteri dicuci dengan larutan garam fisiologis lalu dipecah dengan sonikasi,sediaan ini merupakan endotoksin bakteri yang keluar bila sel bakteri pecah.
Suspensi dari sediaan 1, 2 dan 3 masing masing sebanyak 0.1 ml / 10 gr ikan (dosis bakteri 106 , 107 dan 108 sel / ml ), disuntikkan secara intramuskuler pada ikan ukuran sejari dan ikan dewasa. Maksudnya untuk melihat adakah perbedaan pengaruh eksotoksin,endotoksin dan sel bakteri utuh. dengan mengamati nafsu makan, gejala klinis dan mortalitasnya serta analisis darahnya. Analisa darah yang dilakukan berdasarkan metode Hesser 1960; Korzhuev 1964; Puchkov 1964; Blaxhall and Daisly 1973 dan Mc Carthy et al 1973 yaitu:
a. Jumlah sel darah merah.
b. Jumlah sel darah putih.
c. Diferensial sel darah putih.
d. Kadar hematokrit.
e. Kadar hemoglobin.
Kelompok I: Ikan disuntik secara intraperitoneal dengan 0.1 ml emulsi bakteri virulen 104 cfu/ ml dicampur sampai terjadi emulsi dengan Complete Freund `s Adjuvant ( CFA ),disuntik bakteri virulen setelah 21 hari untuk uji tantang.
Kelompok II: Ikan disuntik emulsi CFA dan larutan garam fisiologis tanpa bakteri,kemudian diuji tantang dengan bakteri virulen setelah 21 hari.
Kelompok III: Ikan disuntik dengan bakteri virulen 104 cfu /ml yang sudah dimatikan dengan pemanasan 60o C, kemudian diuji tantang dengan bakteri virulen setelah 21 hari.
Kelompok IV : Ikan kontrol disuntik larutan garam fisiologis tanpa bakteri,kemudian setelah 21 hari diuji tantang dengan bakteri virulen.
Dari hasil uji ikan yang di imunisasi dapat diketahui mana yang terbaik untuk pencegahan penyakit MAS.
Anonymous. 1984 . Ikan Gurame dan Lele kena wabah penyakit.Bull.Info. Pertanian. 3 : 83-84.
Anonymous. 2001. Patient information Databases /Web Sites Aeromonas. http // www. Med Nets. com, Inc.visited March 13,2001.
Allan, B.J. and Stevenson,R.M. 1981.Extracellular virulence factors of Aeromonas hydrophila in fish infections. Can. J. Microbiol. 27 : 1114-1122.
Angka, S. L. 1990. The pathology of the walking catfish, Clarias batrachus (L) infected intraperitoneally with Aeromonas hydrophila. Asian Fish.Sci. 3 : 343-351.
Angka, S.L.,Pramono, S.U.,Pasaribu, F.H. and Alifuddin, M. 1982. Isolasi dan identifikasi jasad renik penyebab epidemi penyakit bercak merah ikandi Jawa Barat. Bull. Info. Perikanan I (1 ) : 1- 14.
Atkinson ,H. M. and Trust, T. T. 1980.Haemagglutination properties and adherence ability of Aeromonas hydrophila . Infect. Immun. 27 : 938- 946.
Austin, B. and Austin, D.A.. 1987. Bacterial fish pathogens, disease in farmed and wildfish. Ellis Horwood Ltd. England. 364 pp.
Blaxhall, P. C. and Daisley, R. W. 1973. Routine haematological methods for uses with fish blood . J. Fish Biol. 5 : 771-781.
Boon , J . H., Cannaerts , V.M.H., Augustyn , H , Machiels , M.A.W.,de Charleroy, D. and Ollevier ,F. 1990. The effect of different infection levels with infective larvae of Anguillicola crassus on haematological parameters of European eel ( Anguilla anguilla ) .Aquaculture 87 : 243 – 253 .
Boulanger , S.,Lallier, R. and Consineae, G. 1977. Isolation of enterotoxigenic Aeromonas from fish. Can. J. Microbiol 23: 1161-1164.
Brenden, R. A. and Huizinga,H. W. 1986. Susceptibility of normal and X-ray irradiated animals to Aeromonas hydrophila infections. Current Microbiol. 13: 129-132
Buckly, J.T., Halasa, L.N., Lund, K. D. and Mac Intyre, S. 1981. Purification and some properties of the haemolytic toxin aerolysin. Can. J. Biochem. 56: 430- 435.
Bullock, G.L., Conroy,D.A.. and Snieszko, S.F.1971. Bacterial diseases of fishes. Book 2A. In Snieszko ,S.F. and H.R. Axelrod (ed).The diseases of fishes.T.F.H. publ. 112 pp.
Cascón, A., Fregeneda,J.,Aller, M., Yugueros,J., Temprano,A.,Hernanz,C., Sánchez,M., Rodriquez-Aparicio,L. and Naharro,G. 2000. Cloning, characterization, and insertional inactivation of a major extracellular serine protease gene with elastolytic activity from Aeromonas hydrophila.J.Fish Dis.
23 : 49-59.
Chinabut,S., Limsuwan,C., Kitsawat,P. 1991. Histology of the walking catfish, Clarias batrachus . National Inland Fisheries Institute Bangkok.96 pp.
Cumberbatch,N., Gurevith,M.J..,Langston,C.,Sack,R.B. and Brunton,J.L. 1979. Cytotoxic enterotoxin produced by Aeromonas hydrophila : Relationship of toxigenic isolates to diarrheal disease. Infect. Immun.. 23 : 829-837.
Dellman,H.D. and Brown,E.M. 1989. Veterinary histology ( diterjemahkan oleh R. Hartono ).University Indonesia Press. 279 pp.
Dooley,J.S.G., Lallier,R., Shaw, D.H. and Trust,T.J. 1985. Electrophoretic and immunochemical analysis of the lipopolysaccharides from various strains of Aeromonas hydrophila . J. Bacteriol. 164 : 263-269.
Dooley, J.S.G. and Trust,T.J. 1988. Surface protein composition of Aeromonas hydrophila strains virulent for fish : identification of a surface array protein. J. Bacteriol. 170 : 499-506.
Ellis, A.E. 1981. Non specific defence mechanism in fish and their role in disease process. In Anderson,D.P. and W. Hennessen (eds).Developments
in biological standardization Vol.49 : 337-352. Internat. Symp. on Fish Biol.:Serodiagnostic and vaccines,Basel.Switzerland.S.Karger.
de Figueiredo,J.and Plumb,J.A.1977. Virulence of different isolates of A.hydrophila in channel catfish.Aquaculture. 11 : 349-354.
Frerichs,G.N. and Millar,S.D. 1993. Manual for the isolation and identification of fish bacterial pathogens. Pisces Press.Stirling. 60 pp.
Hazen,T.C., Fliermans, C. B., Hirsch,R.P.and Esch,G.W. 1978. Prevalence and distribution of Aeromonas hydrophila in the United States. Appl. Environ. Microbiol. 36 : 731-738.
Hazen,T.C., Raker,M.L.,Esch,G.W. and Fliermans,C.B. 1978. Ultrastructure of red-shore lesions on largemouth bass ( Micropterus salmoides ) association of the ciliate Epistylis sp. and the bacterium Aeromonas hydrophila .J.Protozool. 25: 351-355.
Hesser,E.F. 1960.Methods for routine fish haematology. Progress.Fish Culturist. 22 : 164-170.
Hirono,I. and Aoki,T. 1991.Nucleotide sequence and expression of an extracellular haemolysin gene of Aeromonas hydrophila . Microbial pathogenesis. 11:189-197.
Huizinga,H.W. ,Esch,G.W. and Hazen,T.C. 1979. Histopathology of redsore disease (Aeromonas hydrophila ) in naturally and experimentally infected largemouth bass, Micropterus salmoides. (Lacepide ).J.Fish Dis. 2 : 263-277.
Kanai,K and Takagi,Y. 1986. Alpha-haemolytic toxin of Aeromonas hydrophila produced in vivo. Fish Pathol. 21(4) : 245-250.
Korzhuev,P.A. 1964. Methods of study of blood in fish. In Pavlovskii E.W. (ed) Techniques for the investigation of fish physiology.p.2-10. U.S.Dept.of Interior and Nat.Sci.Found.Washington.
Lewis,D.H. and Plumb, J.A.1979.Bacterial diseases p. 15-24 In : Principal diseases of farm raised catfish. Southern Cooperative Ser. 225.Auburn Univ. Alabama.
Lio-Po, G.D., Albright,L.J. and Alapide-Tendencia,E.V. 1992. Aeromonas hydrophila in the Epizootic ulcerative syndrome, EUS of snakehead ( Ophiocephalus striatus) and catfish ( Clarias batrachus ). Quantitative estimation in natural infection and experimental induction of dermomuscular necrotic lesion. In : Shariff, M., Subasinghe, R.P. and Arthur, J.R.(eds). Diseases in Asian Aquaculture I, Asian Fisheries Society, Manila p.461-474.
Llobrera,A.T. and Gacutan,R.Q. 1987.Aeromonas hydrophila associated with ulcerative disease epizootic in laguna de Bay,Philippines.Aquaculture, 67 (3/4 ): 273-278.
Lucky,Z. 1977. Methods for the diagnosis of fish diseases.Hoffman.,G.L. (ed) Amerind.Publ.New Delhi.p.129-137.
Mc Carthy,D.H.., Stevenson,Y.P., and Roberts,M.S. 1973. Some blood parameters of rainbow trout ( Salmo gairdneri Richardson )I. The kamloops variety.J.Fish Biol.(5) :1-8.
McDaniel,D (Ed). 1979.Procedures for the detection and identification of certain fish pathogens.Am.Fish.Soc.Fish Health Section,Bethesda,M.D. 118 pp.
Meyer,F.P. 1975. The pathology of the major diseases of catfish. In Ribelin,W.E. and G. Migaki (eds) The pathology of fishes. Univ.of Wisconsin . Press.
Nieto,T.P. and Ellis, A.E. 1991. Heterogenicity of extracellular proteases and produced by different isolates of Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria pathogenic for fish. J. Fish Dis. 14 : 229-235.
Popoff,M 1984.Aeromonas In : Krieg,N.R.., Holt,J.G.(eds). Bergey`s: Manual of Systematic Bacteriology.Vol I. Williams and Wilkins, Baltimore.M.D. p 545-548.
Puchkov,N.V. 1964. The white blood Cells In :Pavlovskii, E.N.(ed) Techniques for the investigation of fish physiology p.11-15.U.S. Dept. of Interior and natural Sci. Found. Washington.
Reed,L.J. and Müench,H. 1938.A simple method of estimating fifty percent end points.Amer.J. Hygiene 27: 493-497.
Riddle,L.M.., Graham,T.E. and Amborski, R.L.1981.Medium for the accumulation of extracellular haemolysin and protease by Aeromonas hyrophila .Infect. Immun.33(3): 729-733.
Roberts, R.J. 1993. Motile Aeromonad Septicaemia. In: Inglis, V.,Roberts, R.J. and Bromage, N.R. (eds). Bacterial diseases of fish. Blackwell Scientific Publ.p:143-157.
Roberts, R.J., Frerichs, G.N. and Milan, S.D. 1992. Epizootic ulcerative syndrome, the current position. In: M. Shariff, R.P. Subhasinghe and J.R. Arthur (eds). Diseases in Asian Aquaculture I. Fish health section. Asian Fisheries Society, Manila, p431-436.
Santos, Y., Toranzo, A.E., Dopazo,C.P.Nieto ,T.P.and Barja,J.L. 1987. Relationship among virulence for fish enterogenicity and phenotyphic characteristics of motile Aeromonas. Aquaculture, 67: 29-39.
Seidler, R.J., Allen, D.A., Lockman, H., Colwell, R.R., Joseph, S.W. and Darly, O.P. 1980. Isolation, enumeration, and characterization of Aeromonas from polluted waters encountered in diving operations. Appl. Environ. Microbiol. 39: 1010 – 1018.
Shotts, E.B. Jr. and Rimmler, R. 1973. Medium for the isolation of Aeromonas hydrophila. Appl. Microbiol. 26: 550-553.
Shotts, E.B., Hsu, T.C. and Waltman, W.D. 1985. Extracellular Proteolytic activity of A. hydrophila complex. Fish Pathol, 20(1):37-44.
Stickney, R.R. 1979. Principles of warmwater aquaculture. Wiley Interscience. John Wiley and Sons. 375 pp.
Thune, R.L., Johnson, M.C., Graham, T.E. and Amborski, R.L. 1986. Aeromonas hydrophila b hemolysin: purification and examination of its role in virulence in O-group channel catfish Ictalurus punctatus (Rafinesque). J.Fish Dis. 9.:55 – 61.
Thune, R.L., Stanley, L.A. and Cooper, R.K. 1993. Pathogenesis of gram negative bacterial infections in warmwater fish. In: Faisal, M. and F.M. Hetrich (eds). Annual review of fish diseases. Pergamon Press., New York.
p:37 – 68.
Yin, Z., Lam. T.J. and Sin, Y.M. 1995. The role of spesific antiserum of catfish. Clarias gariepinus, as a defence against Aeromonas hydrophila. Fish and Shellfish Immunol. 6: 57 – 69.