SKRINING ISOLAT-ISOLAT Vibrio SEBAGAI BIOCONTROL UNTUK PENYAKIT KUNANG-KUNANG

Re-edited  20 December, 2000

Copyright © 2000 Widanarni

Makalah  Falsafah Sains (PPs 702)

Program Pasca Sarjana - S3

Institut Pertanian Bogor

 

Dosen:  Prof Dr Ir Rudy C Tarumingkeng

 

STUDI MEKANISME PELEKATAN Vibrio sp. PADA LARVA UDANG WINDU (Penaeus monodon) UNTUK PENAPISAN BAKTERI BIOKONTROL

 

Oleh:

 

WIDANARNI

(P.17600007)

 

 

1.      Latar Belakang

Akhir-akhir ini, terutama sejak krisis moneter melanda Indonesia sehingga nilai dolar melambung tinggi, permintaan terhadap udang windu sebagai produk ekspor meningkat pesat. Pemerintah melalui gema PROTEKAN (Program Peningkatan Ekspor Hasil Perikanan) 2003, mentargetkan pendapatan US $ 10.19 milyar dari perikanan. Dari jumlah tersebut beban terberat digantungkan kepada budidaya udang yang diharapkan mampu menyumbangkan devisa sebanyak US $ 6.79 milyar (Basoeki, 2000).

Namun demikian, berbagai masalah seperti serangan penyakit dan penurunan kualitas lingkungan budidaya masih merupakan kendala utama untuk mencapai tujuan tersebut. Serangan penyakit bakterial pada tingkat pembenihan yang paling serius dan sering menyebabkan terjadinya kematian massal pada larva udang windu adalah serangan bakteri berpendar yang diidentifikasi sebagai Vibrio harveyi, (Lavilla-Pitogo et al., 1990; Pedersen et al., 1998). Upaya untuk menanggulangi penyakit tersebut telah dilakukan dengan secara rutin menggunakan berbagai jenis antibiotika.  Namun penggunaan antibiotika secara terus menerus dengan dosis yang kurang tepat telah mengakibatkan V. harveyi menjadi resisten (Rukyani et al., 1992).

Salah satu cara alternatif untuk mengontrol bakteri patogen pada budidaya udang adalah dengan menambahkan kultur bakteri murni atau campuran (biokontrol) yang telah teruji menghasilkan suatu bahan kimia yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen tersebut.  Cara ini telah terbukti  berhasil dan banyak digunakan pada usaha hewan ternak (Fuller, 1989; Ohhira et al., 1996), namun baru akhir-akhir ini diteliti untuk diaplikasikan pada sistem budidaya perairan, misalnya pada budidaya ikan dan krustase (Tjahyadi et al., 1994; Riquelme et al., 1997; Rengpipat et al., 1998).  Karena larva udang bebas Vibrio tidak tersedia (Widanarni dan Suwanto, 2000), maka Vibrio sp. kandidat biokontrol serta V. harveyi patogen yang diujikan pada larva udang harus diberi penanda (marker) molekuler sebagai gen pelapor.  Dengan demikian, Vibrio berpenanda tersebut dapat dibedakan dari Vibrio lain yang sebelumnya telah terdapat pada larva udang atau air media pemeliharaannya. Esei pelekatan digunakan untuk penapisan bakteri biokontrol karena patogenesitas suatu bakteri antara lain ditentukan oleh kemampuan pelekatan sel bakteri terhadap sel inang serta kemampuannya melakukan kolonisasi dan mensekresi faktor-faktor virulensi (Chart dan Munn, 1980).  Vibrio sp. yang mampu menghambat pelekatan, kolonisasi dan pertumbuhan V. harveyi serta tidak bersifat patogen terhadap larva udang, potensial digunakan sebagai biokontrol untuk melawan Vibrio patogen tersebut.

 

2.  Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari mekanisme pelekatan dan  kemampuan penghambatan Vibrio sp. sebagai biokontrol terhadap pertumbuhan V. harveyi yang bersifat patogen pada larva udang.  Untuk mencapai tujuan tersebut penelitian dibagi dalam beberapa tahap yaitu: (1) Isolasi dan skrining isolat-isolat Vibrio kandidat biokontrol dari tempat usaha pembenihan udang dan habitat alami benih udang; (2) menguji sifat resistensi antibiotik dari masing-masing isolat berkaitan dengan penanda resistensi dari plasmid pembawa gen penanda molekuler; (3) konstruksi, introduksi serta mempelajari stabilitas ekspresi plasmid rekombinan di dalam Vibrio uji sebagai seleksi terhadap Vibrio yang secara alami ada pada larva udang; (4) menguji kemampuan isolat dalam menghambat pertumbuhan V. harveyi secara in vitro dan in vivo pada larva udang; (5) mengkarakterisasi sifat fisiologi, biokimia dan genetik isolat terpilih dengan melakukan kloning dan sekuensing gen 16S rRNA.

 

3.  Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai suatu metode untuk penapisan bakteri biokontrol yang potensial melawan Vibrio patogen, dan dapat menjadi informasi yang penting bagi penanggulangan penyakit vibrosis pada larva udang windu di Indonesia.

 

4.  Tinjauan Pustaka

Serangan penyakit bakterial yang paling serius dan sering menyebabkan terjadinya kematian massal pada larva udang windu adalah serangan bakteri berpendar yang diidentifikasi sebagai V. harveyi  (Lavilla-Pitogo et al., 1990; Pedersen et al., 1998). Bakteri ini pada umumnya menyerang larva udang pada stadia zoea, mysis dan awal post larva (Rukyani et al., 1992) sehingga merupakan kendala dalam penyediaan benih udang yang sehat dalam jumlah besar yang diperlukan untuk produksi udang.

Usaha untuk menanggulangi penyakit tersebut telah dilakukan dengan menggunakan berbagai jenis antibiotika. Namun penggunaan antibiotika secara terus menerus dengan dosis yang kurang tepat telah mengakibatkan V. harveyi menjadi resisten (Lightner et al., 1992; Rukyani et al., 1992).  Hasil penelitian Tjahjadi et al. (1994) menunjukkan bahwa V. harveyi yang diisolasi dari lingkungan pembenihan udang di daerah Kalianget, Besuki, Jawa Timur telah resisten terhadap berbagai jenis antibiotika kecuali rifampisin. Sedangkan penggunaan vaksin sulit diterapkan karena galur V. harveyi yang menyerang larva udang sangat bervariasi (Suwanto et al., 1998). Selain itu, degradasi vaksin yang diserap dapat menimbulkan masalah lain disamping beragamnya galur V. harveyi patogen (Alibi et al., 1999).

Dengan adanya kelemahan-kelemahan dari berbagai upaya yang telah dilakukan, penggunaan biokontrol pada pembenihan udang menawarkan alternatif pemecahan untuk menanggulangi permasalahan tersebut. Dasar pendekatan ini adalah dengan menggunakan aktivitas mikroorganisme yang dapat menekan atau menghambat pertumbuhan V. harveyi tanpa menimbulkan dampak buruk terhadap sistem keseimbangan ekologis mikroba.

Widanarni dan Suwanto (2000) melaporkan bahwa keragaman genetik Vibrio yang diisolasi dari berbagai stadia perkembangan larva udang windu menunjukkan  ada beberapa isolat Vibrio  yang kemudian diidentifikasi sebagai V.  metschnikovii, yang selalu ditemukan mengkolonisasi semua stadia dari telur hingga post larva udang windu serta lingkungan pemeliharaannya. Berdasarkan karakter fisiologi dan genetiknya, isolat-isolat tersebut dapat dibedakan dengan V. harveyi yang telah terbukti bersifat patogen pada larva udang, sehingga penting untuk dipelajari dan dievaluasi lebih lanjut potensinya sebagai biokontrol pada pembenihan udang. Hal yang sama dilaporkan oleh Requelme et al., (1997) dimana Vibrio sp. yang ditemukan berasosiasi dengan larva scallop kemudian terbukti sebagai probiotik yang potensial pada budidaya scallop di Chile.

Karena larva udang bebas Vibrio tidak tersedia (Widanarni dan Suwanto, 2000), maka diperlukan penanda molekuler pada Vibrio biokontrol maupun Vibrio patogen yang akan diujikan.   Dalam bidang biologi molekuler dikenal beberapa gen yang dapat digunakan sebagai penanda molekuler.  Gen yang paling sering digunakan untuk menandai bakteri untuk menelaah aktivitas bakteri di lingkungan alaminya antara lain adalah gen inaZ (Georgakopoulous et al., 1994) dan gen gfp (Manning, 1997).  Gen inaZ jika terekspresi akan menghasilkan protein INA yang mampu mengkatalisis pembentukan es pada temperatur yang relatif hangat, yakni –1.5oC.  Sebagai pelapor, gen inaZ memiliki beberapa kelebihan yaitu ekspresi gen ini dapat dikuantifikasi dan ekspresinya tidak tergantung pada aktivitas metabolisme sel (Georgakopoulous et al., 1994).  Gen gfp jika terekspresi akan menghasilkan protein GFP yang berpendar hijau jika diamati dengan cahaya UV (Manning, 1997), sehingga pengamatan ekspresinya relatif mudah. Selain gen penyandi protein dan enzim, sebagai penanda molekuler juga dapat digunakan gen penyandi resistensi terhadap antibiotika, seperti gen resistensi terhadap gentamisin (GmR) yang dibawa oleh plasposon (Dennis dan Zystra, 1998), atau gen resistensi terhadap rifampisin (RifR) yang dapat diperoleh melalui mutasi spontan.  Penanda RifR dapat digunakan untuk Vibrio karena pada umumnya Vibrio sensitif terhadap antibiotik rifampisin (Tjahyadi et al., 1994).

 

5.               Metodologi

 

Isolasi Vibrio Kandidat Biokontrol

          Vibrio kandidat biokontrol diisolasi dari telur dan larva udang windu serta media pemeliharaannya, termasuk dari kultur pakan alaminya, di tempat pembenihan udang, Labuhan, Jawa Barat, serta dari air laut bebas dan lingkungan perairan bakau yang merupakan habitat alami benih udang.    Masing-masing sampel akan disebar pada media selektif Thiosulphate Citrate Bile Salt agar (TCBS, Oxoid) yang telah ditambah dengan air laut steril.  Kultur selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang (28-31)o C selama 24 jam.  Koloni yang terpisah kemudian dipilih secara acak untuk mendapatkan kultur murni yang akan dipelajari lebih lanjut.

Pengujian Resistensi Antibiotik

          Kultur murni Vibrio kandidat biokontrol ditumbuhkan pada media seawater complete agar (SWC-agar) (5 g bactopeptone, 1 g yeast extract, 3 ml glycerol, 15 g agar, 750 ml air laut, dan 250 ml aquades) dengan suplementasi antibiotik sebagai berikut: spektinomisin (Sp) 50 mg/ml, amoksisilin (Am) 200 mg/ml, ampisilin (Ap) 50 mg/ml, kloramfenikol (Cm) 10 mg/ml, streptomisin (Sr) 50 mg/ml, tetrasiklin (Tc) 5 mg/ml, eritromisin (Er) 20 mg/ml, dan rifampisin (Rf) 50 mg/ml.  Setelah diinkubasi 24 jam pada suhu ruang, respon resistensi dapat diketahui dengan mengamati tumbuhnya koloni pada media tersebut (Tjahyadi et al., 1994).

 

Konstruksi Plasmid Rekombinan dan Transformasinya pada Vibrio

          Kontruksi plasmid rekombinan (masing-masing membawa gen gfp dan gen inaZ), dilakukan dengan metode standar yang digunakan untuk mengisolasi plasmid, analisis endonuklease restriksi, ligasi, dan teknik molekuler lainnya sebagaimana yang dilakukan oleh Sambrook et al. (1989).  Sedangkan Vibrio RifR diperoleh melalui mutasi spontan dengan menumbuhkan Vibrio sensitif rifampisin pada media LA dengan suplementasi rifampisin 50 mg/ml.  Penanda yang memberikan kelangsungan hidup dan stabilitas ekspresi tertinggi kemudian digunakan pada uji in vitro dan in vivo.

 

Pengujian In Vitro Vibrio Kandidat Biokontrol 

          Efek penghambatan masing-masing isolat Vibrio kandidat biokontrol diuji tantang dengan V. harveyi patogen yang masing-masing telah diberi penanda molekuler.  Setiap isolat uji tersebut ditumbuhkan pada 5 ml media LB + air laut dengan kepadatan 102, 104, 106 sel/ml.  Pada tabung yang sama juga ditambahkan 102 sel/ml V. harveyi patogen .  Percobaan ini dilakukan dengan 3 ulangan termasuk kontrol (tanpa isolat biokontrol).  Apabila V. harveyi pada tabung kontrol tumbuh jauh lebih banyak dibanding pada kultur campuran (V. harveyi dicampur dengan kandidat biokontrol), berarti Vibrio uji mampu menghambat pertumbuhan V. harveyi patogen.

 

Uji Tantang pada Larva Udang

          Uji ini dilakukan untuk mengetahui efektivitas penghambatan kolonisasi V. harveyi pada larva udang oleh bakteri kandidat biokontrol. Tiga isolat uji yang paling potensial berdasarkan uji in vitro dipilih pada pengujian ini. Masing-masing suspensi isolat maupun campurannya dimasukkan ke dalam wadah pemeliharaan udang 2 jam sebelum larva udang dimasukkan. Setelah kokultivasi dengan larva udang selama 6 jam, V. harveyi patogen kemudian dimasukkan ke dalam wadah pemeliharaan udang. Percobaan ini dilakukan dengan 3 ulangan termasuk kontrol (V. harveyi sendiri tanpa isolat biokontrol). Pengamatan dilakukan terhadap populasi Vibrio total, V. harveyi patogen dan Vibrio biokontrol, baik pada air pemeliharaan maupun pada larva yang mati. Pengamatan dilakukan setiap 4 jam selama 4 hari. Pada akhir percobaan dihitung pula kelangsungan hidup larva udang.

Karakterisasi Fisiologi, Biokimia dan Genetik Isolat Terpilih

          Terhadap isolat terpilih akan dilakukan karakterisasi fisiologi dan biokimia dengan menggunakan analisis fisiologi microbact (Medved Science, Australia) dan identifikasinya berdasarkan Baumann et al. (1984).  Sedangkan karakterisasi genetik dilakukan dengan melakukan kloning dan sekuensing gen 16S rRNA (Marchesi et al., 1998).

 

6.  Daftar Pustaka

Alibi, A.O., D.A. Jones and J.W. Latchford. 1999. The efficacy of immersion as opposed to oral vaccination of Penaeus indicus larvae against Vibrio harveyi. Aquaculture. 179:1-11.

 

Basoeki, D.M.  2000.  Sumbangan subsektor budidaya udang dalam pencapaian target PROTEKAN 2003: Sebuah studi kasus di TIR Terpadu PT Centralpertiwi Bahari.  Sarasehan Akuakultur Nasional.  Bogor.

 

Baumann P, Furniss AL, Lee JV (1984) Facultative anaerobic gram negative rods. In: Krieg NR (Ed) Bergey’s Manual of Systematics Bacteriology. Williams and Wilkins, Baltimore, MA. Vol. 1:1513-1523.

 

Chart, H. and C.B. Munn.  1980.  Experimental vibriosis in the eel (Anguilla anguilla) p:39-44.  In: W. Ahne (ed).  Fish Diseases.  Third COPRAQ-Session.  Springer-Verlag.  New York.

 

Dennis, J.J. and G. Zylstra.  1998.  Plasposons: Modular self cloning minitransposon derivatives for rapid genetic analysis of negative bacterial genomes.  Appl. Environ. Microbiol. 14:2710-2715.

 

Fuller, R.  1989.  Probiotic in man and animals.  J.Appl.bacterial.66:365-378

 

Georgakopoulos, D.G., M. Hendson, N.J. Panopaulos, and M.N. Schroth.  1994.  Cloning of phenazine biosynthetic locus of Pseudomonas aureofaciens PGS12 and analysis of its expression in vitro with the ice nucleation reporter gene.  Appl. Environ. Microbiol. 53:1113-1117.

Lavilla-Pitogo, C.R., L.L. Baticados, E.R. Cruz Lacierda and L.D. de la Pena.  1990.  Occurrence of luminous bacterial diseases of Penaeus monodon larvae in the Philiphines.  Aquaculture. 91:1-13.

 

Lightner, D.V., T.A. Bell, R.M. Redman, L.L. Mohney, J.M. Natividad, A. Rukyani, and A. Poernomo.  1992.  A review of some major diseases of economic significance in penaeid prawns/shrimp of the Americans and Indopacific. p.57-80. In: M. Shariff, R.P. Subangsinghe and J.R. athur (Eds.).  Diseases in Asian aquaculture I.  Fish Health Section. Asian Fisheries Sociaty. Manila, Philiphines.

 

Manning, E.  1997.  Glow fish: An unusual glowing molecule from jelly fish is helping to illuminate cellular events.  Bioscience.  47;135-138.

 

Marchesi, J.R., T. Sato, A.J. Weightman, T.A. Martin, J.C. Fry, S.J. Hiom, and W.G. Wade.  1998.  Design and evaluation of useful bacterium- specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA.  Appl. Environ. Microbiol. 62:2501-2507.

 

Ohhira, I., T. Tamura, N. Fujii, K. Inagaki, and H. Tanaka.  1996.  Antimicrobial activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus in the culture broth of Enterococcus faecalis TH10, an isolate from Malaysian fermentation food, Temph.  Japanese J. Dairy and Food Sci. 45:93-96.

 

Pedersen, K.L., L. Verdonck, B. Austin, D.A. Austin, A.R. Blanch, P.A.D. Grimont, J. Jofre, S. Koblavi, J.L. Larsen, T. Tiainen, M. Vigneulle, and J. Swings.  1998.  Taxonomic evidence that  Vibrio carchariae Grimes et al., 1985 is a junior synonym of Vibrio harveyi (Johnson and Shunk, 1936), Baumann et al., 1981, Int. J. Sys. Bacteriol. 48:749-758.

 

Rengpipat, S.S., S. Rukpratanporn, S. Piyatiratitivorakul, and P. Menaveta.  1998.  Probiotic in aquaculture: a case study of probiotics for larvae of black tiger shrimp (Penaeus monodon).  In Flegel, T.W.(Ed.) Advances in shrimp biotechnology.  National Center for Genetic Engeneering and Biotecnology.  Bangkok.

 

Riquelme, C., R. Araya, N. Vergara, A. Rojas, M. Quaita, and M. Candia. 1997. Potential probiotic strains in the culture of the chilean scallop Argopecten purpuratus (Lamarck, 1819). Aquaculture. 154:17-26

 

Rukyani, A., P. Taufik dan Taukhid.  1992.  Penyakit kunang-kunang (luminescecce vibrios) di hatchery udang windu dan cara penanggulangan penyakit benur di hatchery udang. J. Litbang Pert. 2:1 -17.

 

Sambrook, J., E.F. Fritsch, and t. maniatis.  1989.  Molecular cloning.  Cold Spring Harbor laboratory press, Cold spring Harbor, New york.

 

Suwanto, A., M. Yuhana, E. Herawaty, and S.L. Angka.  1998.  Genetic diversity of luminous Vibrio isolated from shrimp larvae.  In Flegel T.W. (Ed) Advances in shrimp biotecnology.  National Center for Genetic Engeneering and Biotecnology.  Bangkok.

 

Tjahjadi, M.R., S.L. Angka and A. Suwanto.  1994.  Isolation and evaluation of marine bacteria for biocontrol of luminous bacterial diseases in tiger shrimp larvae (Penaeus monodon Fab.) Aspac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 2:234-352.

 

Widanarni and A. Suwanto. 2000. Genetic diversity of ampicillin resistant Vibrio isolated from various stages of shrimp larvae development.  Biotropia 15:36-47.