Re-edited
Copyright © 2000 Widanarni
Makalah Falsafah Sains (PPs 702)
Program Pasca Sarjana - S3
Institut Pertanian Bogor
Dosen: Prof Dr Ir Rudy C
Tarumingkeng
STUDI MEKANISME PELEKATAN Vibrio sp. PADA LARVA UDANG WINDU (Penaeus monodon) UNTUK PENAPISAN BAKTERI BIOKONTROL
Oleh:
WIDANARNI
(P.17600007)
1.
Latar Belakang
Akhir-akhir ini, terutama sejak krisis moneter melanda
Namun demikian,
berbagai masalah seperti serangan penyakit dan penurunan kualitas lingkungan
budidaya masih merupakan kendala utama untuk mencapai tujuan tersebut. Serangan
penyakit bakterial pada tingkat pembenihan yang paling serius dan sering
menyebabkan terjadinya kematian massal pada larva udang windu adalah serangan
bakteri berpendar yang diidentifikasi sebagai Vibrio harveyi, (Lavilla-Pitogo et
al., 1990; Pedersen et al.,
1998). Upaya untuk menanggulangi
penyakit tersebut telah dilakukan dengan secara rutin menggunakan berbagai
jenis antibiotika. Namun penggunaan
antibiotika secara terus menerus dengan dosis yang kurang tepat telah
mengakibatkan V. harveyi menjadi
resisten (Rukyani et al., 1992).
Salah satu cara
alternatif untuk mengontrol bakteri patogen pada budidaya udang adalah dengan
menambahkan kultur bakteri murni atau campuran (biokontrol) yang telah teruji
menghasilkan suatu bahan kimia yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri
patogen tersebut. Cara ini telah
terbukti berhasil dan banyak digunakan
pada usaha hewan ternak (Fuller, 1989; Ohhira et al., 1996), namun baru akhir-akhir ini diteliti untuk
diaplikasikan pada sistem budidaya perairan, misalnya pada budidaya ikan dan
krustase (Tjahyadi et al., 1994; Riquelme et al., 1997; Rengpipat et al.,
1998). Karena larva udang bebas Vibrio
tidak tersedia (Widanarni dan Suwanto, 2000), maka Vibrio sp.
kandidat biokontrol serta V. harveyi patogen yang diujikan pada larva
udang harus diberi penanda (marker) molekuler sebagai gen pelapor. Dengan demikian, Vibrio berpenanda
tersebut dapat dibedakan dari Vibrio lain yang sebelumnya telah terdapat
pada larva udang atau air media pemeliharaannya. Esei pelekatan digunakan untuk
penapisan bakteri biokontrol karena patogenesitas suatu bakteri antara lain
ditentukan oleh kemampuan pelekatan sel bakteri terhadap sel inang serta
kemampuannya melakukan kolonisasi dan mensekresi faktor-faktor virulensi (Chart
dan Munn, 1980). Vibrio sp. yang
mampu menghambat pelekatan, kolonisasi dan pertumbuhan V. harveyi serta
tidak bersifat patogen terhadap larva udang, potensial digunakan sebagai
biokontrol untuk melawan Vibrio patogen tersebut.
Penelitian ini
bertujuan untuk mempelajari mekanisme pelekatan dan kemampuan penghambatan Vibrio sp.
sebagai biokontrol terhadap pertumbuhan V.
harveyi yang bersifat patogen pada
larva udang. Untuk mencapai tujuan
tersebut penelitian dibagi dalam beberapa tahap yaitu: (1) Isolasi dan skrining
isolat-isolat Vibrio kandidat
biokontrol dari tempat usaha pembenihan udang dan habitat alami benih udang;
(2) menguji sifat resistensi antibiotik dari masing-masing isolat berkaitan
dengan penanda resistensi dari plasmid pembawa gen penanda molekuler; (3)
konstruksi, introduksi serta mempelajari stabilitas ekspresi plasmid rekombinan
di dalam Vibrio uji sebagai seleksi terhadap Vibrio yang secara
alami ada pada larva udang; (4) menguji kemampuan isolat dalam menghambat
pertumbuhan V. harveyi secara in
vitro dan in vivo pada larva
udang; (5) mengkarakterisasi sifat fisiologi, biokimia dan genetik isolat
terpilih dengan melakukan kloning dan sekuensing gen 16S rRNA.
3. Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan
dapat digunakan sebagai suatu metode untuk penapisan bakteri biokontrol yang
potensial melawan Vibrio patogen, dan dapat menjadi informasi yang
penting bagi penanggulangan penyakit vibrosis pada larva udang windu di
Indonesia.
4. Tinjauan Pustaka
Serangan penyakit bakterial yang paling serius dan sering
menyebabkan terjadinya kematian massal pada larva udang windu adalah serangan
bakteri berpendar yang diidentifikasi sebagai V. harveyi (Lavilla-Pitogo et al., 1990; Pedersen et al., 1998). Bakteri ini
pada umumnya menyerang larva udang pada stadia zoea,
mysis dan awal post larva (Rukyani et al., 1992) sehingga
merupakan kendala dalam penyediaan benih udang yang sehat dalam jumlah
besar yang diperlukan untuk produksi udang.
Usaha
untuk menanggulangi penyakit tersebut telah dilakukan dengan menggunakan berbagai jenis antibiotika. Namun penggunaan antibiotika
secara terus menerus dengan dosis yang kurang tepat telah mengakibatkan V. harveyi menjadi resisten (Lightner et al., 1992; Rukyani et al., 1992). Hasil penelitian Tjahjadi et al. (1994) menunjukkan bahwa V. harveyi yang diisolasi dari
lingkungan pembenihan udang di daerah Kalianget, Besuki, Jawa Timur telah
resisten terhadap berbagai jenis antibiotika kecuali rifampisin. Sedangkan
penggunaan vaksin sulit diterapkan karena galur V. harveyi yang menyerang larva udang sangat bervariasi (Suwanto et
al., 1998). Selain itu, degradasi vaksin yang diserap dapat menimbulkan
masalah lain disamping beragamnya galur V.
harveyi patogen (Alibi et al.,
1999).
Dengan adanya kelemahan-kelemahan dari berbagai upaya yang telah dilakukan,
penggunaan biokontrol pada pembenihan udang menawarkan alternatif pemecahan
untuk menanggulangi permasalahan tersebut. Dasar pendekatan ini adalah dengan
menggunakan aktivitas mikroorganisme yang dapat menekan atau menghambat
pertumbuhan V. harveyi tanpa
menimbulkan dampak buruk terhadap sistem keseimbangan ekologis mikroba.
Widanarni dan Suwanto (2000) melaporkan bahwa keragaman genetik Vibrio yang diisolasi dari berbagai
stadia perkembangan larva udang windu menunjukkan ada beberapa isolat Vibrio yang kemudian
diidentifikasi sebagai V. metschnikovii, yang selalu ditemukan
mengkolonisasi semua stadia dari telur hingga post larva udang windu serta
lingkungan pemeliharaannya. Berdasarkan karakter fisiologi dan genetiknya,
isolat-isolat tersebut dapat dibedakan dengan V. harveyi yang telah terbukti bersifat patogen pada larva udang,
sehingga penting untuk dipelajari dan dievaluasi lebih lanjut potensinya
sebagai biokontrol pada pembenihan udang. Hal yang sama dilaporkan oleh
Requelme et al., (1997) dimana Vibrio sp. yang ditemukan berasosiasi
dengan larva scallop kemudian terbukti sebagai probiotik yang potensial pada
budidaya scallop di Chile.
Karena larva udang bebas Vibrio tidak tersedia (Widanarni dan
Suwanto, 2000), maka diperlukan penanda molekuler pada Vibrio biokontrol
maupun Vibrio patogen yang akan diujikan. Dalam bidang biologi molekuler dikenal
beberapa gen yang dapat digunakan sebagai penanda molekuler. Gen yang paling sering digunakan untuk
menandai bakteri untuk menelaah aktivitas bakteri di lingkungan alaminya antara
lain adalah gen inaZ (Georgakopoulous et al., 1994) dan gen gfp
(Manning, 1997). Gen inaZ jika
terekspresi akan menghasilkan protein INA yang mampu mengkatalisis pembentukan
es pada temperatur yang relatif hangat, yakni –1.5oC. Sebagai pelapor, gen inaZ memiliki
beberapa kelebihan yaitu ekspresi gen ini dapat dikuantifikasi dan ekspresinya
tidak tergantung pada aktivitas metabolisme sel (Georgakopoulous et al.,
1994). Gen gfp jika terekspresi
akan menghasilkan protein GFP yang berpendar hijau jika diamati dengan cahaya
UV (Manning, 1997), sehingga pengamatan ekspresinya relatif mudah. Selain gen
penyandi protein dan enzim, sebagai penanda molekuler juga dapat digunakan gen
penyandi resistensi terhadap antibiotika, seperti gen resistensi terhadap
gentamisin (GmR) yang dibawa oleh plasposon (Dennis dan Zystra,
1998), atau gen resistensi terhadap rifampisin (RifR) yang dapat
diperoleh melalui mutasi spontan.
Penanda RifR dapat digunakan untuk Vibrio karena pada
umumnya Vibrio sensitif terhadap antibiotik rifampisin (Tjahyadi et
al., 1994).
5.
Metodologi
Isolasi Vibrio Kandidat Biokontrol
Vibrio kandidat biokontrol
diisolasi dari telur dan larva udang windu serta
media pemeliharaannya, termasuk
dari kultur pakan alaminya, di tempat pembenihan
udang, Labuhan, Jawa Barat, serta
dari air laut bebas dan lingkungan
perairan bakau yang merupakan habitat alami benih udang. Masing-masing sampel akan
disebar pada media selektif Thiosulphate
Citrate Bile Salt agar (TCBS, Oxoid) yang telah ditambah dengan air laut steril. Kultur
selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang (28-31)o C selama 24
jam. Koloni yang terpisah kemudian dipilih
secara acak untuk mendapatkan kultur murni yang akan dipelajari lebih lanjut.
Kultur
murni Vibrio kandidat biokontrol
ditumbuhkan pada media seawater complete
agar (SWC-agar) (5 g bactopeptone, 1 g yeast extract, 3 ml glycerol, 15 g
agar, 750 ml air laut, dan 250 ml aquades) dengan suplementasi antibiotik
sebagai berikut: spektinomisin (Sp) 50 mg/ml,
amoksisilin (Am) 200 mg/ml, ampisilin (Ap) 50 mg/ml,
kloramfenikol (Cm) 10 mg/ml, streptomisin (Sr) 50
mg/ml, tetrasiklin (Tc) 5 mg/ml,
eritromisin (Er) 20 mg/ml, dan rifampisin (Rf)
50 mg/ml. Setelah diinkubasi 24 jam
pada suhu ruang, respon resistensi dapat diketahui dengan mengamati tumbuhnya
koloni pada media tersebut (Tjahyadi et al., 1994).
Kontruksi plasmid
rekombinan (masing-masing membawa gen gfp dan gen inaZ),
dilakukan dengan metode standar yang digunakan untuk mengisolasi plasmid,
analisis endonuklease restriksi, ligasi, dan teknik molekuler lainnya
sebagaimana yang dilakukan oleh Sambrook et al. (1989). Sedangkan Vibrio RifR
diperoleh melalui mutasi spontan dengan menumbuhkan Vibrio sensitif
rifampisin pada media LA dengan suplementasi rifampisin 50 mg/ml. Penanda yang memberikan kelangsungan hidup
dan stabilitas ekspresi tertinggi kemudian digunakan pada uji in vitro
dan in vivo.
Pengujian In Vitro Vibrio Kandidat Biokontrol
Efek
penghambatan masing-masing isolat Vibrio
kandidat biokontrol diuji tantang dengan V.
harveyi patogen yang masing-masing telah diberi penanda molekuler. Setiap isolat uji tersebut ditumbuhkan pada 5
ml media LB + air laut dengan kepadatan 102, 104, 106
sel/ml. Pada tabung yang sama juga
ditambahkan 102 sel/ml V.
harveyi patogen . Percobaan ini dilakukan
dengan 3 ulangan termasuk kontrol (tanpa isolat biokontrol). Apabila V.
harveyi pada tabung kontrol tumbuh jauh lebih banyak dibanding pada kultur
campuran (V. harveyi dicampur dengan
kandidat biokontrol), berarti Vibrio uji mampu menghambat pertumbuhan V. harveyi patogen.
Uji
ini dilakukan untuk mengetahui efektivitas penghambatan kolonisasi V. harveyi pada larva udang oleh bakteri
kandidat biokontrol. Tiga isolat uji yang paling potensial berdasarkan uji in vitro dipilih pada pengujian ini.
Masing-masing suspensi isolat maupun campurannya dimasukkan ke dalam wadah
pemeliharaan udang 2 jam sebelum larva udang dimasukkan. Setelah kokultivasi
dengan larva udang selama 6 jam, V.
harveyi patogen kemudian
dimasukkan ke dalam wadah pemeliharaan udang. Percobaan ini dilakukan dengan 3
ulangan termasuk kontrol (V. harveyi
sendiri tanpa isolat biokontrol). Pengamatan dilakukan terhadap populasi Vibrio total, V. harveyi patogen dan Vibrio biokontrol, baik pada air pemeliharaan maupun pada larva yang
mati. Pengamatan dilakukan setiap 4 jam selama 4 hari. Pada akhir percobaan
dihitung pula kelangsungan hidup larva udang.
Terhadap
isolat terpilih akan dilakukan karakterisasi fisiologi dan biokimia dengan
menggunakan analisis fisiologi microbact (Medved
Science, Australia) dan identifikasinya berdasarkan Baumann et al.
(1984). Sedangkan karakterisasi genetik
dilakukan dengan melakukan kloning dan sekuensing gen 16S rRNA (Marchesi et al., 1998).
6. Daftar
Pustaka
Alibi, A.O., D.A. Jones and J.W. Latchford. 1999. The efficacy of immersion as opposed to oral vaccination of Penaeus indicus larvae
against Vibrio harveyi. Aquaculture. 179:1-11.
Basoeki, D.M. 2000. Sumbangan subsektor budidaya udang dalam pencapaian target PROTEKAN
2003: Sebuah studi kasus di TIR Terpadu
PT Centralpertiwi Bahari. Sarasehan Akuakultur Nasional.
Baumann
P, Furniss AL, Lee JV (1984) Facultative anaerobic
gram negative rods. In: Krieg NR (Ed) Bergey’s Manual of Systematics
Bacteriology. Williams and Wilkins,
Chart, H. and C.B. Munn. 1980.
Experimental vibriosis in the eel (
Dennis, J.J. and G. Zylstra. 1998. Plasposons: Modular
self cloning minitransposon derivatives for rapid
genetic analysis of negative bacterial genomes.
Appl. Environ. Microbiol. 14:2710-2715.
Fuller,
R. 1989.
Probiotic in man and animals. J.Appl.bacterial.66:365-378
Georgakopoulos, D.G., M. Hendson, N.J.
Panopaulos, and M.N. Schroth. 1994. Cloning of phenazine
biosynthetic locus of Pseudomonas aureofaciens
PGS12 and analysis of its expression in vitro with the ice nucleation reporter
gene. Appl. Environ. Microbiol. 53:1113-1117.
Lavilla-Pitogo, C.R., L.L. Baticados, E.R. Cruz
Lacierda and L.D. de la Pena. 1990. Occurrence of luminous
bacterial diseases of Penaeus monodon
larvae in the Philiphines. Aquaculture.
91:1-13.
Lightner, D.V., T.A. Bell, R.M. Redman,
L.L. Mohney, J.M. Natividad,
A. Rukyani, and A. Poernomo. 1992.
A review of some major diseases of economic significance in penaeid prawns/shrimp of the Americans and Indopacific. p.57-80. In: M. Shariff,
R.P. Subangsinghe and J.R. athur
(Eds.). Diseases in
Asian aquaculture I. Fish Health Section. Asian Fisheries Sociaty.
Manning,
E. 1997.
Glow fish: An unusual glowing molecule from jelly fish is helping to
illuminate cellular events. Bioscience. 47;135-138.
Marchesi, J.R., T. Sato, A.J. Weightman, T.A. Martin, J.C. Fry, S.J. Hiom,
and W.G. Wade. 1998. Design and evaluation of useful bacterium-
specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 62:2501-2507.
Ohhira,
Pedersen,
K.L., L. Verdonck, B. Austin, D.A. Austin, A.R.
Blanch, P.A.D. Grimont, J. Jofre,
S. Koblavi, J.L. Larsen, T. Tiainen,
M. Vigneulle, and J. Swings. 1998.
Taxonomic evidence that Vibrio carchariae
Grimes et al., 1985 is a junior
synonym of Vibrio harveyi
(Johnson and Shunk, 1936), Baumann et al., 1981, Int. J. Sys. Bacteriol.
48:749-758.
Rengpipat, S.S., S. Rukpratanporn, S. Piyatiratitivorakul, and P. Menaveta. 1998. Probiotic in
aquaculture: a case study of probiotics for larvae of
black tiger shrimp (Penaeus monodon). In
Flegel, T.W.(Ed.) Advances
in shrimp biotechnology.
Riquelme, C., R. Araya, N. Vergara, A. Rojas,
M. Quaita, and M. Candia. 1997. Potential probiotic strains in the culture of the chilean scallop Argopecten purpuratus (Lamarck, 1819). Aquaculture. 154:17-26
Rukyani, A., P. Taufik
dan Taukhid. 1992. Penyakit kunang-kunang (luminescecce vibrios) di hatchery udang windu dan cara penanggulangan penyakit benur di hatchery udang. J. Litbang Pert. 2:1 -17.
Sambrook, J., E.F. Fritsch, and t. maniatis. 1989. Molecular cloning.
Suwanto, A., M. Yuhana, E. Herawaty,
and S.L. Angka. 1998.
Genetic diversity of luminous Vibrio isolated from shrimp larvae. In Flegel T.W. (Ed) Advances in shrimp biotecnology.
Tjahjadi, M.R., S.L. Angka and A. Suwanto. 1994. Isolation and evaluation of marine bacteria
for biocontrol of luminous bacterial diseases in
tiger shrimp larvae (Penaeus monodon Fab.) Aspac. J. Mol. Biol. Biotechnol.
2:234-352.
Widanarni and A. Suwanto. 2000. Genetic diversity of ampicillin
resistant Vibrio
isolated from various stages of shrimp larvae development. Biotropia 15:36-47.