PROPOSAL PENELITIAN

 

Re-edited  20 December, 2000

Copyright © 2000 Sumardi  

Makalah  Falsafah Sains (PPs 702)

Program Pasca Sarjana - S3

Institut Pertanian Bogor

 

Dosen:  Prof Dr Ir Rudy C Tarumingkeng

 

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI PENGHASIL PROTEASE TAHAN ASAM

UNTUK SUPLEMEN PAKAN AYAM BROILER

(PROPOSAL PENELITIAN)

 

 

Oleh

S u m a r d i

NPM 17600006   PS Biologi

xanthomb@indo.net.id

 

 

PENDAHULUAN

 

 

Latar Belakang

Akhir-akhir ini ada kecenderungan bahwa masyarakat di negara maju lebih mengutamakan makanan yang bebas dari pencemaran bahan-bahan kimia sintetik dan residu antibiotik. Disamping beracun, bahan-bahan tersebut dapat menyebabkan timbulnya kanker. Oleh karena itu tidak mengherankan apabila terjadi kasus ekspor broiler Indonesia ditolak oleh negara tujuan, karena adanya residu antibiotik di dalam karkas.

            Dalam era globalisasi, khususnya setelah diberlakukan Asean Forum Trade Association (AFTA), penolakan semacam ini merupakan usaha proteksi. Dalam kesepakatan AFTA, proteksi dengan membatasi kuota tidak dibenarkan lagi. Dengan demikian dinamika ekspor-impor akan ditentukan oleh persaingan harga, persaingan kualitas, dan bebas dari pencemaran bahan kimia yang berbahaya bagi kesehatan. Kondisi ini bagi Indonesia akan merupakan suatu hambatan ekspor apabila  petani dan peternak terus menggunakan zat-zat kimia tanpa batas (Suharsono, 1991).

            Di negara-negara yang sudah maju, usaha peningkatan kualitas ternak terus dilakukan. Beberapa penelitian terakhir memperlihatkan bahwa suplemen enzim dalam pakan ternak untuk hewan monogastrik, berpotensi meningkatkan nilai nutrisinya termasuk unggas (Graham et al, 1988, Annison, 1992, Wenk et al, 1993). Di dalam saluran pencernaan ayam proses pencernaan terjadi secara enzimatis. Oleh karena itu beberapa peneliti telah mencoba menambahkan enzim dalam pakan ayam untuk melihat pengaruhnya terhadap pertumbuhan ayam. Salah satu enzim yang pernah dicoba adalah pemberian enzim ß-glukanase dalam pakan ayam broiler. Pemberian enzim tersebut dapat menurunkan kekenyalan (viscositas) isi usus hingga 20% dibandingkan dengan makanan standarnya (biji-bijian  tanpa enzim) (sterling et al, 1998). Dengan demikian proses pencernaan makanan di usus menjadi lebih mudah. Enzim lain yang tidak kalah perannya dalam proses pencernaan tersebut adalah protease. Enzim tersebut berperan dalam pemecahan protein menjadi asam amino. Asam amino selanjutnya diserap ke tubuh ayam untuk selanjutnya diubah menjadi protein tubuh (Wahju, 1992).

            Guna mendapatkan enzim protease yang berpotensi dalam meningkatkan nilai nutrisi pakan, maka enzim tersebut harus memiliki aktivitas biologi saat mencapai saluran gastrointestinal (Spring et al, 1995). Saluran gastrointestinal ayam mempunyai pH asam (4-5). Oleh karena itu seleksinya harus diisolasi dari mikroorganisme yang hidup di saluran gastrointestinal ayam dengan menggunakan medium yang bersifat asam.

            Setelah mikroorganisme terisolasi kemudian harus diidentifikasi. Sampai saat ini, identifikasi mikroba penghasil protease masih banyak dengan menggunakan isolat dan kultur murni yang kemudian dianalisis sifat fisiologi dan biokimianya saja. Sehingga mikroba yang tidak terisolasi (not yet cultured) tidak dapat diidentifikasi. Dengan kemajuan bidang biologi molekuler, identifikasi semua organisme dapat dilakukan dengan analisis gen 16s-rRNA ini sesuai untuk identifikasi mikroorganisme karena gen ini terdapat di semua organisme. Sekarang telah diketahui terdapat lebih dari 4000 entri (sekuen yang terdaftar) yang ada pada database 16s-rRNA yang mencakup sekitar 1800 spesies yang jumlahnya terus bertambah (Bottger, 1996 dalam Desiliyarni, 1999).

            Isolat mikroorganisme yang diperoleh diharapkan dapat digunakan sebagai probiotik. Menurut Fuller (1992), probiotik adalah suatu food supplement-mikroorganisme hidup yang secara menguntungkan mempengaruhi inang melalui perbaikan keseimbangan mikroorganisme. Penggunaan probiotik tersebut dapat digunakan untuk meningkatkan kualitas ternak yang ramah lingkungan. Sejumlah mikroorganisme ditemukan dalam pencernaan ayam, diantaranya Escherichia coli, Clostridia, Enterococci, Lactobacilli dan khamir. Mikroorganisme tersebut merupakan flora normal yang terdapat dalam alat pencernaan ayam. Menurut Couch (1978), penambahan kultur Lactobacillus dalam pakan ayam dapat meningkatkan berat ayam broiler sampai 46 gram, menurunkan tingkat kematian sampai 0,4% dan meningkatkan konversi pakan sampai 0,81 unit. Disamping itu penambahan kultur L. acidophilus dalam pakan dapat menghambat pertumbuhan Salmonella typhimurium dan Staphylococcus aureus, dimana kedua bakteri tersebut merupakan bakteri patogen. 

            Pada penelitian lain yang dilakukan oleh Nuryani (1998), penggunaan tepung Bio H+ sebanyak 60% yang merupakan probiotik dalam ransum berpengaruh nyata dalam meningkatkan konsumsi ransum ayam broiler. Probiotik tersebut mengandung berbagai jenis mikroba yang bersifat : lignolitik, selulotik, proteolitik, dan lain-lain.

           

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk

  1. Mengisolasi bakteri penghasil protease,
  2. Mengamati morfologi koloni/sel,
  3. Mengisolasi enzim protease,
  4. Menetapkan aktivitas protease,
  5. Mengidentifikasi bakteri dengan sekuensing gen 16s-rRNA,
  6. Melihat pengaruh bakteri penghasil protease sebagai suplemen pakan ayam broiler.

 

Hipotesis

Hipotesis yang diajukan terdiri atas dua macam, yaitu hipotesis nol dan hipotesis satu. Hipotesis nol terdiri atas :

  1. Tidak terdapat isolat bakteri penghasil protease,
  2. Tidak teramati morfologi koloni/sel,
  3. Tidak terisolasi enzim protease,
  4. Tidak dapat ditetapkan aktivitas protease,
  5. Tidak teridentifikasi bakteri dengan sekuensing gen 16s-rRNA,
  6. Tidak terlihat pengaruh bakteri penghasil protease sebagai suplemen pakan ayam broiler.

 

Hipotesis satu terdiri atas :

  1. Terdapat isolat bakteri penghasil protease,
  2. Teramati morfologi koloni/sel,
  3. Terisolasi enzim protease,
  4. Dapat ditetapkan aktivitas protease,
  5. Teridentifikasi bakteri dengan sekuensing gen 16s-rRNA,
  6. Terlihat pengaruh bakteri penghasil protease sebagai suplemen pakan ayam broiler.

 

BAHAN DAN METODE

 

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilakukan pada bulan Mei 2001 sampai dengan Februari 2002 di Laboratorium Mikrobiologi, PAU Bioteknologi IPB Bogor.

 

Metode Penelitian

Dalam penelitian ini akan dilakukan beberapa kegiatan yaitu pengambilan contoh isi usus ayam, yang kemudian diisolasi bakteri penghasil protease. Bakteri yang diperoleh kemudian dikarakterisasi morfologi dan sifat fisiologi/biokimianya yaitu meliputi morfologi sel dan aktivitas enzim protease. Bakteri yang mempunyai enzim dengan aktivitas tinggi selanjutnya diidentifikasi dengan cara analisis sekuenzing gen 16s-rRNA. Pada akhirnya bakteri yang telah teridentifikasi tersebut diuji kemampuannya sebagai probiotik untuk ayam broiler.

 

Pengambilan Contoh

Sebanyak lima puluh (50) contoh kotoran dalam usus ayam diambil dari berbagai daerah tingkat II di Propinsi Lampung. Dari setiap contoh diambil sebanyak kira-kira 10 g. Setiap contoh diberi label seperlunya. Seluruh contoh tersebut dikumpulkan dan diusahakan disimpan pada suhu 4oC.

 

Isolasi dan Seleksi Awal Bakteri Penghasil Protease

Isolasi dilakukan dengan menggunakan medium Luria Agar (0,5 g yeast ekstrak, 1 g tripton, 1 g NaCl, 1 g skim milk, 1,5 g agar pH 4-5).  Mula-mula contoh kotoran dibuat pengenceran hingga 10-4. Kemudian suspensi tersebut divorteks, lalu sebanyak 0,1 ml dipipet dan disebarkan pada medium isolasi dengan tiga kali ulangan. Cawan-cawan tersebut diinkubasi dengan posisi balik pada suhu 37oC selama 24-48 jam. Koloni bakteri yang menghasilkan protease akan memperlihatkan zona jernih disekelilinginya.

 

Pengamatan Ciri-ciri Morfologi Koloni dan Sel

Isolat-isolat yang sudah murni diamati morfologi koloninya, yang meliputi bentuk, tepian, elevasi, dan konsistensi (Hadioetomo, 1986). Selain itu, setiap koloni(umur 24-72) dibuat lekapan basahnya untuk mengamati bentuk sel, bentuk dan letak spora dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000 kali.

 

Seleksi Bakteri Penghasil Protease

Penyiapan Inokulum

Isolat bakteri ditumbuhkan dalam agar miring berisikan medium LA + Skim milk. Setelah tumbuh, seluruh biakan direndam dalam medium cair dengan komposisi yang sama dan dibiarkan semalam. Setelah itu biakan dilepaskan dari permukaan agar dan seluruh suspensi dipindahkan ke dalam labu Erlenmeyer 200 ml berisi 25 ml medium cair dan dikocok diatas mesin pengocok horizontal dengan kecepatan kurang lebih 120 putaran per menit pada suhu 37oC selama 24-48 jam. Pada akhir masa inkubasi, biakan ini dipakai sebagai inokulum. 

Penyiapan Enzim

Ke dalam labu Erlenmeyer 250 ml yang berisi 50 ml medium LB + Skim milk, diinokulasikan 3% inokulum (O.D.620 = 1, yaitu sekitar 1x108 sel per ml. Labu tersebut diinkubasikan di atas mesin pengocok seperti disebutkan di atas selama 24 jam. Pada akhir pengocokan, biakan disentrifugasi pada kecepatan kurang lebih 1000 x g selama 10 menit pada suhu 4oC (Beckman Ultracentrifuge Model J2-21). Supernatan yang mengandung enzim protease kasar disimpan dari endapannya dan siap untuk ditetapkan aktivitasnya.

 

Penetapan Aktivitas Enzim

Satu ml supernatan dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambah 1 ml larutan kasein Hammerstein 1% dalam larutan buffer asetat 0,05 M (pH 4-5), lalu diinkubasikan pada penangas air suhu 370C selama 20 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 3 ml larutan asam trikloroasetat 10% (b/v). Hasil reaksi tersebut disentrifugasi dengan kecepatan kurang lebih 15000 x g selama 10 menit pada suhu 40C. Supernatan tersebut dipisahkan dan diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 280 dengan menggunakan tirosin sebagai standar. Satu unit aktivitas enzim protease adalah sejumlah enzim yang menimbulkan reaksi tak terendapkan oleh larutan TCA (trichloro acetic acid) dan memberikan nilai absorbansi setara dengan 1 mg tirosin per menit pada suhu 370C.

 

Isolasi dan Pemurnian DNA

Suspensi sel isolat bakteri sebanyak 1,5 ml dimasukkan ke dalam tabung  mikro dan disentrifuse selama 30 detik. Supernatan dibuang kemudian tabung ditambahkan suspensi sel lalu disentrifuse kembali. Pelet yang terbentuk disuspensi dalam 567ml TE kemudian dilarutkan dengan sempurna. Suspensi yang terbentuk ditambah 30 ml larutan SDS 10% dan 3 ml proteinase K (2 mg/ml), kemudian dicampur dengan membolak-balikkan tabung lalu diinkubasi  pada suhu 370C selama satu jam. Suspensi ditambah 0,7 ml larutan fenol: kloroform : isoamil alcohol (25:24:1) dicampur dengan cara membolak-balikkan tabung sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi selama 5 menit. Supernatan dipindah dengan hati-hati dengan pipet Pasteur atau ujung pipet 1000 ml, interfase harus dihindari. Supernatan dimasukkan dalam tabung mikro yang bersih. Untuk mengendapkan DNA ditambahkan 0,6 ml isopropanol. Tabung dibolak-balik sampai terbentuk benang-benang putih kemudian disentrifus selama 10 menit. Supernatan dibuang kemudian ditambahkan 1 ml etanol 70% dingin, lalu disentrifus selama 2-4 menit. Supernatan dibuang, tabung dikeringkan dengan kertas tisu, pellet DNA dikeringkan dalam desikator selama 15 menit atau kering udara 3-4 jam. Kemudian DNA diresuspensikan dengan menambahkan 100 ml x TE (Suwanto, 1993).

 

Penggunaan Berbagai Bakteri Penghasil Protease Tahan Asam dalam Ransum Ayam Broiler

Perlakuan dalam percobaan ini adalah berbagai jenis bakteri penghasil protease yang ditambahkan dalam ransum ayam. Ransum yang digunakan dalam penelitian ini adalah ransum komersial comfeed. Sedangkan kontrolnya adalah ransum komersial yang tidak ditambah bakteri. Ayam broiler diberi perlakuan sampai umur 8 minggu. Setelah umur broiler 8 minggu kemudian peubah yang diamati yaitu : konsumsi ransum, pertambahan berat tubuh, konversi ransum, bobot dan persentase karkas.

 

JADWAL PENELITIAN

No

Kegiatan

Bulan

 

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

Persiapan

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2

Pelaksanaan

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Pengambilan Contoh di Lampung

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Isolasi dan Seleksi Awal Bakteri Penghasil Protease

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Pengamatan Ciri-ciri Morfologi Koloni dan sel

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Seleksi Bakteri Penghasil Enzim Protease

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3

Pembuatan laporan

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Analisis data

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Penulisan laporan

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

DAFTAR PUSTAKA

 

Annison, G. 1992. Commercial Enzyme Supplementation of Wheat-based diets Raises Ileal Glycanase Activities and Improves Apparent Metabolisable Energy, Starch and Pentosan Digestible in Broiler Chickens. Anim. Feed Sci. Technol. 38:105-212

 

Couch, J.R. 1978. Poultry Reseachers Outline Benefits of Bacteria, Fungistatic Compouns, Other Feed Additivies. Feedstuffs 50,6

 

 

Desiliyarni, T. 1999. Analisis Keragaman Genetik Bakteri Termofilik dari Kawah Candradimuka, Pegunungan Dieng dengan Teknik PCR-RFLP gen 16s-rRNA. Tesis Program Pascasarjana. IPB. Bogor.

 

Fuller, R. 1992. Probiotics the Scientific Basis. Chapman and Hall. London.

 

Graham, H., W. Loewgren, D. Petterson, and P. Aman. 1988. Effect of Enzyme Supplementation on Digestion of Barley Pollard-Based Pig Diet. Nutr. Rep. Int. 38: 1073-1139

 

Hadioetomo, RS. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Penerbit PT Gramedia Jakarta.

 

Nuryani, A.1998. Pengaruh Penggunaan Berbagai Tingkat Bio H+ dalam Ransum terhadap Bobot dan Presentase Karkas, giblet, serta Lemak Abdominal Broiler. Fak. Pertanian Unila. Bandar Lampung.

 

Sterling, K.G., JM. Harter-Dennis, MJ. Estienne, and K.V. McElwain. 1998. Effect of Enzyme Addition in Pelleted vs. Mash Barley Based Diets for Broilers. Abstract American Society of Animal Science Northeast Section. 76: 81

 

Suharsono, 1991. Probiotik Alternatif Pengganti Antibiotik dalam Bidang Peternakan. Fak. Peternakan UNPAD. Bandung.

 

Suwanto, A.1993. Teknik Percobaan dalam Genetika Molekuler. Jur. Biologi. FMIPA IPB. Bogor

 

Wahju, 1992. Ilmu Nutrisi Unggas. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.

 

Wenk, C., R. Koelliker, and R. Messikommer. 1993. Whole Maize Plants in Diets for Growing Pig: Effects of Three Different Enzymes on the Feet Utilization. Pages 165-169 in : Prosiding of The First Symposium of Enzymes in Animal Nutrition. Kartause Ittingen, Switzerland.