USULAN PENELITIAN

Re-edited  20 December, 2000

Copyright © 2000 Irawan    

Makalah  Falsafah Sains (PPs 702)

Program Pasca Sarjana – S3

Institut Pertanian Bogor

 

Dosen:  Prof Dr Ir Rudy C Tarumingkeng

 

 

 

 

EKSPLORASI ENZIM XYLANOLITIK TERMOFILIK:

KLONING GEN PENYANDI XYLANASE

(Usul Penelitian)

 

 

 

Oleh:

 

IRAWAN

995205

 

 

 

 

 

1.  LATAR BELAKANG PENELITIAN

Xylan merupakan komponen utama dari hemiselulosa pada dinding sel tanaman, yang terikat pada selulosa, pektin, lignin dan polisakarida lainnya untuk membentuk  dinding sel.  Enzim yang berperan dalam mendegradasi xylan mendapat perhatian besar karena mempunyai kegunaan dalam berbagai proses industri, terutama dalam konversi bahan lignoselulosa menjadi bahan bakar dan dalam pemrosesan hemiselulosa menjadi kertas.  Selain itu hasil hidrolisis xylan dapat digunakan dalam pembuatan tablet dan artificial low calorie sweeteners (Kulkarni et. al., 1999; Chen and Westpheling, 1998; Gibbs et. al., 1995).  Selama proses pemutihan bubur kertas, xylanase (EC 3.2.1.8) yang digunakan untuk menggantikan klorin dapat meningkatkan daya ekstraksi lignin sehingga menghasilkan kertas berkualitas tinggi.  Penggunaan xylanase, baik   untuk   menggantikan   atau   mengurangi jumlah   klorin yang digunakan dalam proses pemutihan bubur kertas, memberikan dampak yang baik terhadap kelestarian lingkungan (Morris et. al., 1998). Dengan demikian, penggunaan xylanase untuk proses pemutihan bubur kertas secara komersil membutuhkan produksi enzim yang murah dan dalam jumlah besar (Bergquist and Morgan, 1992).

2.                  TUJUAN PENELITIAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengklon gen penyandi xylanase termofilik 

 

 

2.                  TINJAUAN PUSTAKA

Perhatian terhadap mikroorganisme termofilik, baik yang aerobik maupun anaerobik, meningkat pesat beberapa tahun terakhir ini dan banyak bakteri baru dan menarik yang telah dideskripsikan (Bergquis et. al., 1989; Brock, 1985).  Enzim yang berasal dari mikroorganisme ini mempunyai resistensi terhadap proses denaturasi oleh suhu tinggi dan solven dan mempunyai aktivitas pada suhu yang tinggi (Zeikus, 1979).  Banyak penelitian yang ditujukan pada enzim yang berasal dari bakteri pendegradasi selulosa dan hemiselulosa, karena biopolimer ini merupakan biomasa yang terbanyak  di biosfer ini dan merupakan sumber bahan baku organik.   

Penggunaan xylanase dalam industri kertas dan pulp saat ini mendapat perhatian besar karena adanya peraturan lingkungan hidup yang ketat terutama pada penggunaan klorin dalam proses pemutihan  kertas dan pulp.  Perlakuan xylanase sebelum proses pemutihan kertas dan pulp dilaporkan dapat menggurangi penggunaan bahan kimia pemutih dan memberikan hasil akhir yang lebih baik.  Proses pemutihan secara enzimatik menyebabkan pemutusan ikatan antara lignin dan karbohidrat serta membuka struktur pulp sehingga memudahkan masuknya bahan pemutih.  Dalam proses pemutihan pulp, sangat diperlukan enzim dengan pH (pH 9-10) dan suhu optimum yang tinggi (70-80°C).    Xylanase termostabil dari bakteri anerobik termofilik Dictyoglomus sp. telah diuji kemampuannya  dalam proses pemutihan pulp.  Perlakuan xylanase pada suhu 80°C dan pH 6 – 8 menghasilkan peningkatan derajat pemutihan sebanyak 2 satuan ISO dalam satu tahap proses delignifikasi dengan peroksida.    Xylanase komersial untuk proses pemutihan pulp pertama kali dipasarkan oleh Novo Nordisk A/S dengan nama Pulpzyme HA, yang berasal dari Trichoderma reesei.  Setelah itu bermunculan nama–nama lain seperti Cartazyme HS dari Sandoz Chemicals, Irgazyme 40 yang dihasilkan dari T.  longibrachiatum dan T. harzianum E 58, Ecopulp (Alko-ICI), Cartazyme-NS-10 (Clariant) dan Pulpzyme HC (Novo Nordisk) yang kesemuanya telah dicoba dalam proses pemutihan pulp dan hasilnya menunjukkan penurunan yang signifikan terhadap penggunaan ClO2 dan H2O2 (Kulkarni et. al., 1999).  Meskipun demikian xylanase tersebut bukan enzim termofilik alkalofilik yang ideal dibutuhkan dalam industri pulp dan kertas saat ini.

Selain kegunaan diatas xylanase juga berperanan penting dalam proses macerasi bahan sayuran, protoplastasi sel tanaman, klarifikasi jus dan wine, recovery minyak dari tambang-tambang minyak di subterania, ekstraksi flavor, pigmen, minyak tumbuhan dan pati.  Xylanase murni dari T. viridae ternyata dapat menginduksi biosintesis etilen dan dua protein yang berkaitan dengan serangan patogen pada tanaman tembakau yang menunjukkan adanya peranan xylanase pada mekanisme pertahanan tanaman terhadap patogen.  Xylanase pada proses perkecambahan benih tanaman berperanan dalam mengkonversi cadangan makanan menjadi produk yang dapat digunakan.  Selain itu juga berperanan dalam proses elongasi sel, pelunakan buah dan dipercaya terlibat dalam berbagai fungsi fisiologis penting yang belum diketahui secara jelas prosesnya.  Pada hewan ternak non ruminansia, makanan yang mengandung bahan hemiselulosa meningkatkan viskositas pakan di dalam lambung, sehingga mengganggu penetrasi enzim pencernaan dan absorbsi nutrisi serta mendukung masuknya  patogen terutama pada ayam broiler (Kulkarni et. al., 1999).  Oleh karena itu, xylanase juga memberikan sumbangan dalam formulasi pakan ternak masa depan.

Untuk menuju ke arah komersialisasi dibutuhkan proses produksi xylanase yang ekonomis, oleh karena itu sangat penting untuk mendapatkan mikroorganisme yang mampu menghasilkan enzim ini dalam jumlah banyak.  Produksi xylanase pada bakteri termofilik menjadi tidak ekonomis karena membutuhkan suhu tinggi dan biasanya hasilnya rendah. Teknik DNA rekombinan memberikan kemungkinan untuk meningkatkan produksi protein enzim ini.  pada bakteri mesofilik dan dapat dibuat overproduksi dengan teknik biologi molekuler yang ada.

5.  METODOLOGI

Isolasi DNA .  DNA genom dari bakteri xylanolitik termofilik diisolasi menggunakan IsoQuick Nucleic Acid Extraction kit (ORCA Research Inc., Washington)  sedangkan DNA plasmid diisolasi menggunakan Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega, Madison) 

            Konstruksi pustaka genom.  DNA genom dari bakteri xylanolitik termofilik didigesti secara parsial menggunakan enzim Sau3AI dan fragmen dipisahkan dengan dielektroforesis pada agarosa 0.8%.  Fragmen berukuran 5-6 kb dipotong dan diisolasi dari agarosa menggunakan Jetsorb Gel Extraction Kit (PGC Scientifics, Maryland).  Vektor kloning pSJ1678 (shuttle vektor) didigesti dengan enzim BamHI dan fragment berukuran 3.8 kb diisolasi dari gel agarosa.  Vektor dan insert kemudian diligasikan dan ditransformasikan ke dalam Bacillus substilis  menggunakan metode transformasi protoplast ( Chang and Cohen, 1979). 

            Skrening transforman.  Transforman yang tumbuh dimedia LA yang diberi antibiotik kanamisin (25mg/ml)  kemudian dibuat  replikanya.  Setelah diinkubasi 37° semalam, satu cawan kemudian dilapisi dengan media LA + 0.5% oat spelt xylan dengan konsentrasi agar 0.8% dan    dipindahkan ke suhu 65°C .Setelah 7 jam diamati pembentukan zona bening disekitar koloni.

            Plasmid rekombinan diisolasi dari Bacillus substilis dan ditransformasikan kembali ke dalam E. coli DH5a untuk proses subkloning.  Subkloning dilakukan menggunakan eksonuklease Bal31 dengan berbagai variasi waktu inkubasi untuk mendapatkan potongan fragmen yang berbeda dan diligasikan kembali ke plasmid vektor yang sesuai.

  1.  DAFTAR PUSTAKA

Bergquist , P.L., D.R Love, J. E. Croft , M.B. Streiff, R. M. Daniel, and H. W. Morgan.  1989.  Genetics and potential biotechnological application of thermophilic and extremely thermophilic archaebacteria and eubacteria.  Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 5:199-244

 

Bergquist, P. L. and H. W. Morgan.  1992.  The molecular genetics and biotechnological application of enzymes from extremely thermophilic eubacteria. In Herbert, R. A. and R. J. Sharp (ed.). Molecular Biology and Biotechnology of Extremophiles.  Chapman and Hall.  New York, USA.

 

Brock, T. D. 1985.  Life at high temperatures.  Science 230:132-138. 

 

Chang, S. and Cohen, S. N. 1979.  High frequency transformation of Bacillus substilis protoplast by plasmid DNA.  Mol. Gen. Genet.  168:111-115.

 

Chen, C.C., and J. Westpheling.  1998.  Partial characterization of the Streptomyces lividans xlnB promotor and its use for expression of a hermostable xylanase from Thermotoga maritima.  Appl. Environ. Microbiol. 64:4217-4225.

 

Gibbs, M. D., R. A. Reeves, and P. L. Bergquist.  1995.  Cloning, sequencing, and expression of a xylanase gene from the extreme thermophile Dictyoglomus thermophilum Rt46B.1 and activity of the enzyme on fiber-bound substrate.  Appl. Environ. Microbiol.  61:4403-4408.

 

Kulkarni, N., A. Shendye, and M. Rao.  1999.  Molecular and biotechnological aspects of xylanases.  FEMS Microbiol. Rev. 23:411-456.

 

Morris, D. D., M. D. Gibbs, C. W. J. Chin, M. H. Koh, K. K. Y. Wong, R. W. Allison, P. J. Nelson, and P. L. Bergquist.  1998.  Cloning of the xynB gene from Dictyoglomus thermophilum Rt46B.1 and action of the gene product on kraft pulp.  Appl. Environ. Microbiol.  64:1759 -1765.

 

Shendye, A., and M. Rao.  1993.  Molecular cloning and expression of xylanases from an alkalophilic thermophilic Bacillus (NCIM 59) in Bacillus substilis A8.  Enzyme Microb.  Technol.  15:343-347.

 

Shendye, A., Gaikaiwari, R. and M. Rao.  1994.  Expression of the cloned xylanases from an alkalophilic thermophilic Bacillus in Bacillus substilis.  World J. Microbiol. Biotechnol.  10:414-416.

 

Zeikus, J.G.  1979.  Thermophilic bacteria : ecology, physiology and technology.  Enzyme Microb. Technol. 1:243-252

 

 

7.      JADWAL PELAKSANAAN PENELITIAN

 

Aktivitas

bulan

 1    2    3     4     5     6     7     8     9     10


Isolasi DNA

 


Pembuatan pustaka genom

 


Skrening pustaka genom

 


Subkloning rekombinan