Re-edited 20 December, 2000

Copyright © 2000 Diana Elizabeth Waturangi

Makalah Falsafah Sains (PPs 702)

Program Pasca Sarjana

Institut Pertanian Bogor

Dosen: Prof Dr Ir Rudy C Tarumingkeng

KERAGAMAN GENETIK SERTA UJI RESISTENSI ANTIBIOTIK Escherichia coli

YANG DIISOLASI DARI FESES Varanus spp

Oleh :

Diana Elizabeth Waturangi

99.5129/Biologi

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Mikroorganisme memiliki habitat alami yang beragam. Beberapa habitat yang baik untuk organisme tingkat tinggi juga dapat menunjang pertumbuhan mikroorganisme. Tetapi ada beberapa habitat dikarenakan faktor fisik ataupun faktor kimia yang ekstrem, organisme tingkat tinggi tidak dapat tumbuh sedangkan mikroorganisme dapat bertahan bahkan berkembang dengan baik. Mikroorganisme dapat hidup pada permukaan tubuh dari organisme tingkat tinggi ataupun pada bagian dalam dari hewan, tumbuhan dan manusia. Beberapa mikroorganisme yang hidup di dalam hewan memberikan keuntungan untuk kebutuhan nutrisi dari hewan tersebut (Brock & Madigan, 1997).

Mikroorganisme indigenous dapat hidup baik pada permukaan kulit, mulut, saluran pernapasan bagian atas, saluran kemih maupun saluran pencernaan. Mikroflora indigenous yang hidup dalam saluran pencernaan telah diketahui memiliki pengaruh baik secara anatomi, fisiologi maupun perubahan imunologik terhadap inangnya (Berg, 1996). Salah satu mikroorganisme indigenous pada saluran pencernaan hewan ialah Escherichia coli begitu pula pada Varanus.

Yogiara (1998) telah melaporkan bahwa E.coli hasil isolasi dari mulut Varanus menunjukkan diversitas genetik. Diversitas genetik dari E.coli sebagai mikroflora diduga berhubungan secara spesifik dengan inangnya.

Sekuen rRNA 16S digunakan untuk menganalisa diversitas genetik. rRNA 16S telah banyak dimanfaatkan untuk melakukan analisis filogeni baik pada prokariot maupun eukariot (Braun-Hoeland et al., 1992).

Bakteri yang telah diisolasi juga diuji resistensinya terhadap beberapa antibiotik, karena bakteri pada lingkungan alaminya menunjukkan resistensi terhadap beberapa antibiotik (Desselberger, 1998). Selain daripada itu bakteri yang diisolasi dari lingkungan rumah sakit seperti E.coli menunjukan multiresistensi (Neu, 1992). Limbah dari rumah sakit mengandung bakteri enterik yang meunjukkan tingkat resistensi antibiotik yang tinggi (Guardabassi et al., 1998). Karena itu, deteksi serta karakterisasi gen resistensi antibiotik menjadi sangat penting.

Adapun tujuan dari penelitian ini adalah : Melakukan isolasi, karakterisasi, uji resistensi terhadap antibiotik serta analisa gen rRNA 16S E.coli hasil isolasi dari feses Varanus.

TINJAUAN PUSTAKA

Mikroflora indigenous

Mikroflora indigenous usus tidak didapati secara spontan pada manusia ataupun hewan yang baru lahir, beberapa mikroba berkolonisasi pada tempat tertentu di usus selang beberapa saat setelah lahir. Mikroflora indigenous dapat diklasifikasikan atas : Autochthonous, yaitu mikroorganisme yang ada selama evolusi dari hewan dan biasanya ada pada semua komunitas dari spesies hewan tertentu. Flora normal, yaitu mikroorganisme yang didapati pada semua anggota dari komunitas spesies hewan tertentu tapi tidak harus ada pada semua komunitas hewan tersebut. Patogen, mikroorganisme yang berada pada waktu tertentu dan secara normal tidak didapati pada semua anggota dari komunitas hewan tersebut. Mikroorganisme indigenous dapat hidup baik pada permukaan kulit, mulut, saluran pernapasan bagian atas, saluran kemih ataupun saluran pencernaan (Berg, 1996).

Resistensi terhadap antibiotik

E.coli merupakan mikroba komensal dan patogen yang penting yang hidup dalam saluran pencernaan manusia maupun hewan. Bakteri ini telah diketahui menunjukkan resistensi terhadap beberapa antibiotik (Neu, 1992). Hal ini dapat menjadi sumber penyebaran resistensi yang penting pada patogen lain dari manusia ataupun hewan. Gen resistensi dari bakteri yang telah resisten terhadap antibiotik tersebut dapat disebarkan melalui feses manusia ataupun hewan ke organisme lain di lingkungan (Dunlop et al., 1998).

Bakteri dapat bersifat resisten terhadap antibiotik karena adanya mutasi kromosom ataupun karena pertukaran material genetik melalui transformasi, transduksi dan konjugasi melalui plasmid (Neu, 1992).

Faktor yang berperan dalam perkembangan resistensi terhadap antibiotik ialah : Peningkatan ataupun kesalahan penggunaan antibiotik dalam bidang klinik, mekanisme transformasi, transduksi ataupun konjugasi, penggunaan tehnik deteksi molekular, penambahan antibiotik pada pakan ternak (Desselberger, 1998).

Pendekatan konvensional untuk uji resistensi antibiotik didasarkan atas pertumbuhan koloni pada media selektif dengan atau tanpa penambahan antibiotik (Siegel et al., 1974). Bagaimanapun juga analisa profil DNA merupakan cara yang penting untuk melakukan karakterisasi dan identifikasi gen resistensi antibiotik.

Analisis sekuen rRNA 16S

Analisis asam nukleat merupakan metode yang terbaik untuk melakukan klasifikasi ataupun mendeterminasi kekerabatan antar organisme. Salah satu metode Analisis Sidik jari DNA ialah melihat sekuen rRNA 16S.

Kemampuan analisis rRNA 16S untuk membuat hubungan filogeni antar organisme telah banyak dilaporkan (Braun-Howland et al., 1992). RNA ribosomal merupakan molekul yang telah terevolusi diantara organisme hidup. Molekul ini bersifat homolog baik secara fungsional ataupun evolusinya pada organisme yang berbeda; dan merupakan molekul yang strukturnya terkonservasi; berada dalam jumlah besar di dalam sel sehingga mudah diisolasi dari berbagai organisme; ukuran sekuennya cukup besar untuk dibandingkan sehingga bersifat signifikan secara statistik (Olsen et al., 1986).

BAHAN DAN METODE

Beberapa spesies reptile di kumpulkan dari berbagai daerah di Indonesia. Feses dari reptile diambil dan dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 2 ml larutan fisiologi NaCl 0.85%.

Isolasi E.coli dari feses reptil

Bakteri diisolasi dan dikultivasi pada medium EMB (Eosin Metilen Blue) (Difco, Laboratories, Michigan), sebanyak 20 ul sampel disebar pada medium tersebut dan diinkubasi selama 18 jam pada suhu 37°C. Tehnik kuadran dilakukan untuk mendapatkan koloni tunggal lalu diinokulasi ke dalam medium EMB.

Uji fisiologi bakteri

Escherichia coli merupakan bakteri dengan ciri fisiologi tidak dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbon satu-satunya, merah metil positif serta indol positif.

Uji Merah Metil

Pada uji ini disiapkan tabung yang sudah berisi medium MR (metil red). Bakteri diinokulasikan ke dalam tabung dan diinkubasi selama 18 jam pada suhu 37 °C.

Setelah inkubasi maka dilakukan penambahan larutan indikator sebanyak 3-4 tetes. Hasil yang positif ditunjukkan dengan perubahan warna medium menjadi merah artinya terbentuk asam.

Uji Sitrat

. Bakteri ditumbuhkan dalam medium Sitrat dan diamati pertumbuhannya setelah periode inkubasi selama semalam pada suhu 37°C. Hasil uji yang positif ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan bakteri pada medium ini, disamping adanya perubahan warna medium dari hijau menjadi biru.

Uji Indol

Bakteri yang telah ditumbuhkan pada medium kaldu Tripton 1% diteteskan dengan reagen Kovac sebanyak 10-12 tetes. Hasil yang positif ditunjukkan dengan terbentuknya lapisan berwarna merah di atas biakkan.

Uji resistensi terhadap antibiotik

Bakteri diuji resistensinya terhadap beberapa antibiotik dengan menggunakan tehnik cawan replika, yaitu dengan menumbuhkan bakteri pada dua jenis medium dengan penambahan antibiotik serta medium tanpa antibiotik lalu keduanya diinkubasi pada suhu 37°C selama 18 jam dan diamati pertumbuhan yang terjadi.

Antibiotik yang digunakan adalah : ampisilin 100 ug/ml, tetrasiklin 10 ug/ml, streptomisin 50 ug/ml, kanamisin 25 ug/ml, gentamisin 20 ug/ml, trimetoprim 25 ug/ml, serta khloramfenikol 25 ug/ml.

Analisis Keragaman Genetik

PCR-RFLP rRNA 16S

Gen 16S rRNA dari E.coli hasil isolasi dari feses reptile diamplifikasi dengan PCR dengan primer 16f. Dalam tabung mikro 0.2 ml dicampur larutan : 2.5 ul 10X bufer (Finnzyme), 0.5 ul campuran dNTP (Finnzyme) 1 ul primer 63F; 1 ul primer 1387r, 1 ul DNA polymerase (Finnzyme), serta ddH₂0 hingga volume akhir mencapai 25 ul sedangkan DNA cetakan digunakan koloni bakteri langsung. Kontrol negatif dibuat tanpa penambahan DNA.

Siklus dilakukan sebanyak 30 kali meliputi : 94° C selama 2 menit ; 92° C selama 30 detik (denaturasi); 55° C selama 30 detik (penempelan); 75° C selama 60 detik (pemanjangan); 72° C selama 20 menit; setelah 30 siklus suhu dipertahankan pada 4° C.

Untuk memeriksa hasil amplifikasi dilakukan elektroforesis. 3 ul sampel DNA dicampur dengan 2 ul loading bufer lalu diinjeksikan ke dalam agarosa 1% dengan 1X bufer Tris Acetic EDTA (TAE). Elektroforesis dilakukan selam 60 menit, 100 mV lalu diamati di bawah sinar ultraviolet.

Digesti dengan Enzim restriksi

RsaI, Sau3A, HaeIII and CfoI merupakan enzim restriksi yang digunakan untuk analisis ini. Dalam tabung mikro dicampurkan DNA hasil amplifikasi sebanyak 3 ul, bufer enzim restriksi 2ul, enzim restriksi 5 Unit dan sisanya ditambahkan ddH₂0 hingga mencapai volume total 20 ul. Inkubasi dilakukan pada suhu dan waktu yang disesuaikan dengan kondisi aktivitas enzim.

Setelah digesti ditambahkan larutan penghenti reaksi sebanyak 5 ul, kemudian hasilnya dianalisis dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 2.5%, 45 mV.

DAFTAR PUSTAKA

Berg, R.D. 1996. The indigenous gastrointestinal microflora. Trends Microbiol. 4:430-435.

Braun-Howland, E.B., S.A. Danielsen, and S.A. Nierzwicki-Bauer. 1992. Development of a rapid method for detecting bacterial cells in situ using 16S rRNA-targeted probes. Biotehniques. 13:928-933.

Brock, T.D, and M.T. Madigan. 1991. Biology of microorganism. 8^th ed. Prentice-Hall, Inc., New Jersey.

Desselberger, U. 1998. Resistance to antibiotics and other antimicrobial agents. SGM Quarterly 25:94-95.

Dunlop, R.H., S.A. McEwen., A.H. Meek., R.C. Clarke., R.. Friendship., W.D. Black, and A.N. Sharpe. 1998. Measurement of antimicrobial resistant Escherichia coli in pig feces with a hydrophobic grid membrane filter interpreter system. Appl. Environ. Microbiol. 64:366-369.

Guardabassi, L., A. Petersen., J.E. Olsen, and A. Dalsgaard. 1998. Antibiotic resistance in Acinetobacter spp. Isolated from sewers receiving waste effluent from a hospital and a pharmaceutical plant. Appl. Environ. Microbiol. 64:3499-3502.

Neu, C.H. 1992. The crisis in antibiotic resistance. 257:1064-1072.

Siegel, D., W.G. Huber, and F. Enloe. 1974. Continuous non-therapeutic use of antibacterial drugs in feed and drug resistance of the gram negative enteric florae of food producing animals. Antimicrob. Agents Chemother. 6:697-701.

Walter, M.V, and J.W. Vennes. 1985. Occurrence of multiple antibiotic resistant enteric bacteria in domestic sewage and oxidation lagoons. Appl. Environ. Microbiol. 50:930-933.

Yogiara., A. Suwanto, and W. Erdelen. 1999. Antibiotic resistance and genetic diversity of Escherichia coli isolated from Indonesian monitor lizard (Varanus spp). Researh report. Departement of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Science, Bogor Agricultural University, Bogor.